制药领域的技术进步和突破性发展正日益猛烈地敲响“无药可用”堡垒的大门，值得注意的是，21 世纪出现了大环化合物，其中环肽尤其令人感兴趣。这类新的潜在候选药物在经典小分子药物和较大的蛋白质药物之间的占据了巨大化学空间。近日沃夫化学奖得主Hiroaki Suga对核苷酸编码质谱库筛选 (NELS) 技术发现靶向不可成药靶标的大环肽进行了综述（10.1021/acs.chemrev.4c00422）。
不可成药靶点
不可成药靶点虽然存在争议和主观评价，但也达成一些共识。缺乏明确疏水核心结合口袋的蛋白质，例如small GTPases。这些蛋白质通常在关键的生物过程中发挥关键作用，但表现出平坦或无特征的表面，不适合传统的配体结合。由于缺乏明确的结合位点，因此无法通过传统的理性和/或计算机辅助设计方法开发结合剂。蛋白质蛋白质相互作用 (PPI) 由于涉及大而浅的相互作用表面以及许多相互作用的瞬态性质，用小分子靶向 PPI 非常具有挑战性。内在无序蛋白质(IDP) 在生理条件下缺乏稳定的三维结构，而是以相互转换构象的动态集合体形式存在。IDP 在信号传导、调控和分子识别中发挥着至关重要的作用，但对传统的药物发现方法提出了重大挑战。肽或小蛋白质结合剂是理想的候选药物，因为它们的尺寸比小分子药效团更适合与更大的表面相互作用。
核苷酸编码质谱文库筛选技术
核苷酸编码质谱文库筛选技术有4种，分别是：噬菌体展示技术；裂解内含肽介导的环状连接肽和蛋白质 (SICLOPPS)；mRNA 展示技术；分散-混合技术。
噬菌体展示技术将编码肽的 cDNA 插入噬菌体的外壳蛋白基因中，随后在大肠杆菌中表达，然后将感兴趣的肽展示在噬菌体表面。由于表达的表型（即表达的肽）与其遗传特征直接相关，因此可以识别出最优先选择的序列并进行反复选择，最终导致最强结合序列的富集。噬菌体展示的主要缺点是其文库规模相对较小，这主要是由于所需的转化步骤造成的，其效率限制了可操作的文库大小并引入了某些偏差。
裂解内含肽介导的环状连接肽和蛋白质 (SICLOPPS) 依赖于使用内含肽，即自我切除的蛋白质，它们编码在质粒文库中随机肽编码 DNA 序列的两侧。在细菌系统中转录和翻译时，两个内含肽相互作用形成活性物质，该活性物质会剪接并产生环状肽作为副产物。尽管该过程不受所产生肽的大小限制，但最多只能引入约 6 个随机残基才能完全覆盖文库。此外，内含肽切割需要半胱氨酸或丝氨酸残基作为肽的第一个氨基酸。SICLOPPS 的主要优点是在细胞内选择。因此，可以筛选环肽的功能而不是结合，从而确保获得生物活性物质，而不是非特异性结合物，另一个优点是其可灵活地与多种基于细胞的检测方法相结合，能够轻松高效地筛选功能性结合。
mRNA 展示技术在体外的无细胞环境中，会更加昂贵和复杂，但也具有显著优势：通过消除转化步骤及其固有的偏差和局限性，可以处理更大的文库，通常大约超过一万亿个不同的序列，更大的文库显著增加了找到更优结合物的机会，另一优势是其与遗传密码重编程的强有力结合。该技术也存在一些缺点，它倾向于产生非特异性结合物，并且它筛选的是亲和力而不是功能性。因此，通过 mRNA 展示鉴定的结合物不一定是有效的抑制剂。
分散-混合技术将原始反应性化合物拆分成几个部分，然后与各种化合物反应。然后将得到的混合物汇集、混合、再次分离，并进行新一轮的化学反应，依赖于合成化学而不是转化机制。优势在于，一次拆分和汇集活动中可以探索巨大的化学空间，将蛋白质和非蛋白质结构块结合在一起，并直接受益于合成研究的进步。同样，只需几步拆分和汇集合成，就可以生产出大量不同的化合物。
NELS 衍生的环肽用于难以成药的靶点
靶向细胞内蛋白质
环肽临床最大障碍是极其差的细胞膜通透性，将环肽送入细胞的策略可分为三大类方法：（1）与细胞穿透基序（如 CPP）结合，（2）对肽结构进行结构操纵，例如掩盖某些极性部分（类肽），（3）基于载体的递送，例如使用脂质体。Craik 和 Henriques 团队报道了环状 CPP 结合肽（称为“诱饵肽”）的设计。
Small GTPases
Small GTPases是生物开关，将GTP 转化为 GDP 后会触发各种信号级联。这些蛋白质通常以平坦的表面为特征，为治疗干预带来了巨大的障碍。针对这些靶标对大型大环肽库进行 NEL筛选尤其有吸引力。例如KRas长期以来一直是不可成药靶点，作为 GTPase，它对 GTP 具有皮摩尔亲和力，而抑制剂很难与之竞争，并且它的表面没有明显的结合位点可以靶向。2020 年，Shokat 和 Suga 合作鉴定了 KRas（G12D）的大环肽抑制剂，采用改进的 RaPID 选择来选择结合剂。
PPIs
蛋白质相互作用 (PPI) 在控制信号转导、基因调控和蛋白质功能的各种生物过程中发挥着重要作用。PPI 通常涉及大而平坦的相互作用表面，因此它们特别难以用小分子药物抑制。大环肽非常适合 PPI 抑制，它更大的潜在结合面积与 PPI 表面的结合面积更匹配，氨基酸残基（包括非蛋白质残基）可以以固有模仿自然相互作用的方式与热点相互作用。例如，Tavassoli 团队报道的 SICLOPPS 获得的缺氧诱导因子 1 (HIF-1)，该化合物在缺氧 U2OS 和 MCF7 细胞系中表现出微摩尔范围的抑制作用。
内在无序蛋白质
内在无序蛋白质 (IDP) 在多种生物过程中发挥着重要作用，包括信号传导、调节和蛋白质相互作用。它们不仅缺乏标准的结合口袋，而且结构不明确和/或构象动态使其难以难以成药。例如，转录因子 Myc，它在 75% 以上的癌症中异常活跃。今年Li 等人 报道了Myc 的双环肽抑制剂，主要候选药物 NT-B2R 可直接影响 Myc。尽管 NT-BR2 不具有细胞通透性，但在使用脂质体进行细胞内递送后，它也导致模型 Myc 依赖性胶质母细胞瘤 U87 的增殖和代谢活性降低，EC50 为 1 μM。
总结
不同设计的环肽已被证明能够靶向以前被认为无法成药的靶点，例如 KRas 和 p53/MDM2 相互作用，发现已经通过各种方法设计了相当多的肽抑制剂。但目前环肽仍然受到膜通透性差的困扰。将PPI 或无序区域的性质和相互作用的信息整合到各种可用的 NELS 技术中将简化获取环肽的途径，从而打破不可成药。
参考文献doi: 10.1021/acs.chemrev.4c00422
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