辉瑞展示了两种非活性 CCR6 结构，与变构拮抗剂 CCR6/SQA1/OXM1 和 CCR6/SQA1/OXM2 形成三元复合物。OXM1 和 OXM2 是高度选择性的 CCR6 拮抗剂，通过结合细胞外口袋干扰受体激活网络。溶液中，OXM 类似物显示出类似于结合形式的 U 形构象。SQA1 则与 G 蛋白结合位点重叠的细胞内口袋结合，稳定了无活性构象。这项研究补充了对 CCR6 激活机制的理解，并揭示了小分子拮抗剂的多功能性，为靶向 CCR6 的药物发现提供了新见解。趋化因子受体 (CKR) 是一类与趋化因子细胞因子家族相互作用的 A 类 G 蛋白偶联受体 (GPCR)，在多种生理过程中发挥重要作用，如免疫反应和炎症。人类已有 20 多种 CKR，包括与 Gi 蛋白偶联的常规 CKR 和非典型 CKR。CCR6 是其中一个关键的 CC 型 CKR，主要通过其配体 CCL20 激活，促进淋巴细胞迁移到炎症部位。CCR6 在多种慢性炎症疾病中表达上调，因此成为重要的药物靶点。此前辉瑞报道了一种活性 CCR6 的结构，揭示了 CCL20 和 G 蛋白的结合模式。在本研究中，辉瑞科学家展示了两种无活性 CCR6 结构，分别与方酰胺 (SQA) 和氧代吗啉 (OXM) 系列的变构拮抗剂形成三元复合物。这些结构通过单粒子低温电子显微镜 (cryo-EM) 确定，显示了小分子对 CCR6 的不同变构机制，且 SQA 和 OXM 类似物在拮抗 CCR6 时未表现出协同作用。这些发现突显了小分子对 GPCR 变构调节的复杂性和多样性。SQA1（图 1a）最初作为 CXCR2 抑制剂被发现，后来也被证实能抑制 CCR6 活性。OXM 类似物 OXM1 和 OXM2（图 1a）则通过基于 SQA1 的虚拟筛选发现，并经过结构-活性关系 (SAR) 研究。这三种小分子均强烈抑制了内源性 CCR6 的趋化性（图 1b），并显著稳定 CCR6（图 1c），显示了它们的直接结合能力。令人意外的是，SQA 和 OXM 分子对 CCR6 的稳定作用具有叠加效应，表明它们与 CCR6 的不同口袋结合并可同时存在。
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图 1：SQA 和 OXM 类似物抑制 CCL20 介导的 CCR6 激活并显示出对受体的附加结合稳定性为了揭示 SQA 和 OXM 类似物如何与 CCR6 结合，作者采用了工程化 CCR6 构建体 Nα7.1 进行低温电子显微镜 (cryo-EM) 研究。该构建体在跨膜结构域中包含七个热稳定丙氨酸取代和点突变 L1343.41W，以提高受体表达。研究表明，SQA 和 OXM 类似物与热稳定 CCR6 构建体的结合力与野生型 (WT) 受体相当，并且在稳定构建体中观察到它们之间的附加稳定作用（图 1d）。为提高蛋白质的同质性，对 CCR6 进行了 N 端和 C 端的截断，并用脱辅基细胞色素 b562 (BRIL) 取代了 ICL3 的部分残基。通过抗 BRIL Fab 和抗 Fab 纳米抗体 (Nb) 标记，成功确定了 CCR6/SQA1/OXM1 和 CCR6/SQA1/OXM2 的复合结构，分辨率分别为 3.3 Å 和 3.0 Å。这些结构揭示了 SQA 和 OXM 类似物与 CCR6 的不同口袋结合（图 2），展示了在 7TM 结构域内的配体结合模式及其对后续结构分析的可靠建模。![]()
图 2：CCR6 与 OXM 和 SQA 类似物复合的整体结构在 CCR6 的两种重建中，U 形密度在细胞外口袋中解析，并与 OXM1 和 OXM2 进行拟合（图 2a、b）。OXM 类似物通过与 TM 3、4、5、6 和 ECL2 侧链的疏水相互作用与 CCR6 结合（图 2c、3a-d）。OXM1 的对氯苯基和 OXM2 的对三氟甲基苯基夹在 TM 5 和 TM 6 之间，与 F1293.36、L2195.43、F2235.47、I2686.49、M2726.53 和 L2756.56 形成疏水相互作用。氧代吗啉核心的酰胺氮（OXM1 的茚满基团和 OXM2 的双环[1.1.1]戊烷）结合在一个由 ECL2 封盖的疏水口袋中。OXM1 的较大茚满基团形成 T 型 π 堆积，稳定了 U 型构象。此外，OXM 类似物的极性侧链通过 H 键进一步增强结合。OXM1 对 CCR6 高度选择性，但对其他 CKR 不有效。为了探究 OXM1 在溶液中的构象，我们使用了核磁共振 (NMR) 实验。通过旋转框架核 Overhauser 增强信号 (ROE) 的测定，我们观察到茚满 C(sp3)-H (H-18) 和对氯苯基环 (Hs-3,4,6,7) 之间的分子内相互作用，表明这些相互作用在溶液中依然保持。我们在压缩二甲基亚砜 (DMSO) 凝胶中对 OXM1 进行了质子和碳分配分析，并计算了质子-碳和质子-氮的残余偶极耦合 (RDC) 值。RDC 数据与分子动力学模拟生成的低能构象集合拟合良好，输出了多个 U 形构象，其中92% 的低能构象与低温电子显微镜中观察到的结合姿势非常相似（图 3e）。环丙基的构象限制和茚满与对氯苯基之间的 T 型 π 堆积相互作用被认为是稳定 OXM1 U 型构象的关键。进一步合成了 OXM3 和 OXM4，这些类似物在溶液中呈现延伸构象，并且没有显示长距离 ROE 或 NOE 信号（图 3e），说明它们对 CCR6 不具有活性。同时，OXM2 的溶液构象也显示出类似的弯曲构象，尽管缺少茚满部分（图 3e）。长程 NOE 信号进一步确认了 OXM2 的弯曲构象。这些结果支持了游离状态下的低能弯曲构象对于 OXM 类似物活性的关键作用。![]()
图 3：与 CCR6 结合的 OXM 类似物的结构以及与溶液构象的比较
与 OXM 类似物不同，SQA 分子 SQA1 的细胞内结合位点被揭示（图 2d、4）。在 CCR6/SQA1/OXM1 复合物中，SQA1 的结合姿势在两种结构中几乎相同。SQA1 与 CCR6 的结合主要通过 TM 1、2、3、6、7 和螺旋 8 的侧链进行，包括广泛的极性相互作用和疏水相互作用。特别是，G3208.47 位点的甘氨酸缺乏侧链，形成了一个结合口袋；带有 G3208.47V 的 CCR6 突变体完全消除 SQA1 结合（图 4c、d）。此外，SQA1 的方酰胺核心与 D822.40、S792.37、T812.39、R1433.50 和 K3228.49 的极性侧链形成了多个 H 键。比较 SQA1 在 CCR6 和 CXCR2 上的结合结构，发现 SQA1 与这两个受体共享一个保守的结合口袋（图 4e）。在两者中，方酰胺-吡啶酰胺核心均介导广泛的极性相互作用。然而，1-(4-异丙基呋喃-2-基)丙基部分在 CCR6 和 CXCR2 的结合位置存在差异。在 CXCR2 中，该部分向细胞内推移约 1 Å，这可能是由于 1.57 位置的侧链差异（CCR6 为 F711.57，CXCR2 为 I731.57）。异亮氨酸侧链使得 CXCR2 的子口袋变小，导致 1-丙基向下推移，并且 SQA1 在 CXCR2 中的 4-异丙基呋喃部分相对于 CCR6 发生旋转。![]()
SQA 和 OXM 通过不同的变构机制拮抗 CCR6结合的 CCR6 结构在非活性构象中发生了显著的变化（图 5a）。将 SQA 和 OXM 结合的 CCR6 结构与 CCL20 结合结构比较，发现 OXM 和 SQA 的结合位点与 CCL20 不重叠，表明它们作为 CCR6 的变构拮抗剂（图 5b）。在非活性构象中，CCR6 的 7TM 束经历了显著重排，TM6 向内移动 4-5 Å，TM7 的 IC 尖端向外移动 4.6 Å（图 5c、d），导致 IC 口袋闭合并且与 G 蛋白结合不兼容。保守的功能基序和 H 键网络（如 Y1253.32-Q2676.48-N2716.52）在非活性结构中得到了类似于其他无活性 A 类 GPCR 的构象（图 5e-h）。OXM 类似物的结合可能通过稳定这些 H 键网络，进一步促进 CCR6 的失活状态。SQA1 通过结合于 CCR6 的非活性 IC 口袋，阻碍了 G 蛋白的偶联（图 5b）。SQA1 的结合位点与参与 G 蛋白结合和 CCR6 激活的保守基序（D3.49R3.50Y3.51 和 N7.49P7.50xxY7.53）相关，包括 R1433.50 和 Y3167.53。它们在 SQA1 结合时处于非活性构象（图 5f、g），表明 SQA1 通过空间竞争阻止了 G 蛋白结合及关键激活基序的构象变化，从而抑制 CCL20 介导的 CCR6 激活。类似的细胞内拮抗剂已被报道，如 CXCR1/2、CCR2、CCR7、CCR8 和 CCR9，它们可能利用类似机制调节受体。与此不同，OXM 类似物结合于 7TM 的细胞外口袋，离 CCL20 结合位点约 9 Å（图 5g）。OXM 的结合重塑了 CCR6 的正构口袋，使其与 CCL20 结合时的构象截然不同（图 5b、c）。OXM1 和 OXM2 的结合通过与 ECL2 的 N186 和环的 C 末端相互作用，使 ECL2 的 β 发夹更靠近 EC 口袋的中心 4 Å，导致与 CCL20 的 N 末端冲突。同时，OXM 类似物的对位取代苯基将 TM5 推离 7TM 束中心 8 Å，为 TM6 向内移动 4-5 Å 留出空间。这种大幅移动使 TM6 的 EC 末端构象不再与 CCL20 对接兼容。因此，OXM 结合通过稳定不同的 EC 区域构象来抑制 CCL20 介导的 CCR6 激活。尽管正构激动剂与 G 蛋白之间的正协同作用已被广泛研究，但不同变构配体间的串扰较少被关注。我们研究了 [3H]SQA1 在有无 OXM1 的 CCR6 上的结合，发现 OXM1 的存在并未增强 [3H]SQA1 的结合，与正构 CCR2 拮抗剂的现象不同。使用稳定 CCR6 的 SPR 实验也显示，SQA1 对 OXM1 结合的影响微小。这些数据表明，OXM 和 SQA 分子占据的两个变构口袋之间的通讯有限，这与正构激动剂和细胞内信号传导器的协同作用不同。![]()
尽管低温电子显微镜在活性 GPCR 结构测定方面已取得显著进展，但在小分子结合的无活性 GPCR 结构分析中应用仍面临挑战，如受体体积小和高度动态性。本文介绍了一个成功的案例，通过低温电子显微镜解决了无活性 GPCR 结构测定的问题。该研究引入了 BRIL 融合蛋白，并使用精心设计的连接点替换 ICL3，以增加受体的刚性。BRIL/Fab/Nb 模块作为基准标记，显著提升了粒子排列的稳健性。结合热稳定突变和变构拮抗剂的三元复合策略，成功解析了 CCR6 与 SQA 和 OXM 类似物的高分辨率结构。这些结构揭示了 SQA 和 OXM 通过不同的变构机制抑制 CCR6 激活。此外，这些发现对基于结构的药物发现和靶向其他相关 CKR 的小分子药物具有重要的参考价值。
文献DOI: 10.1038/s41467-024-52045-7
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