孕烷 X 受体 (PXR) 是一种配体激活的转录因子，可结合多种化合物并上调药物代谢机制。PXR激活不利于药物的疗效和安全性，因为它会降低活性药物浓度并增加反应性代谢物，从而导致毒性和或药物相互作⽤。近日圣犹德儿童研究医院Taosheng Chen小组报道了诱导PXR降解PROTAC的设计，阻止了激动剂诱导的基因表达并增强了化疗药物紫杉醇的抗癌作⽤(doi:10.1021/acs.jmedchem.4c01926）
PROTAC的设计
激动剂 T0901317 的结合会形成一个紧凑的埋藏口袋，但类似物 T0-BP 会取代α螺旋 2 (α2)，从而引入一个孔。α2区域具有一定程度的灵活性，甚至在某些晶体结构中都无法观察到。与 T0901317 和 T0-BP 不同，SJB7和类似物会刺穿α12上方的 PXR 表面。因此，基于磺酰基的 SJB7和相关的酰胺连接支架为潜在的接头连接提供了两个溶剂可及点：α2 (位点 1) 和α12 (位点 2)。
为了验证将接头连接到磺酰基 SJB7 的位点 1 或位点 2 以及相关的酰胺连接支架不会导致 PXR 结合的丧失，合成了两种荧光探针并测试了通过时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 测定法标记 PXR LBD。⽤13测试位点 1，⽤14测试位点 2。两种探针与 PXR LBD 的结合率相当，表观解离常数(KD)分别为 38.7 nM (13)和 22.3 nM (14)。
化合物15-21在酰胺连接支架的位点 1 与 VHL 配体 VH032 结合，改变的连接体长度、组成和连接位置。在七种化合物中，只有15 种在处理 24 小时后降低了 PXR 蛋白水平，但作⽤较弱，半最大降解浓度(DC50)为886 nM，最大降解(Dmax)为 33.1%。15的AUC为 61.1，而对照未结合 VH032 的 AUC为 33.8。15在24和72 小时处理中也表现出很小的细胞毒性，15的接头位置与 16-21 上的接头位置不同，这表明位点 1 可能具有接头方向偏好。
为了确定是否位点 1 或位点 2 是更好的起点，合成并测试了化合物22-34 ，其中位点 2 结合 PXR 配体 SJB7 与 VH032。13 种化合物中，有两种表现出 PXR 降解活性（28和32），命中率与位点 1 类似物相同。尽管15、28和32的DC50、Dmax和 AUC在化合物中都相对相似，但28的Dmax（41.4%）⾼于15（33.1%）。
酰胺取代与位点 1 苯环上的额外疏水部分相结合，可提⾼ PXR 结合亲和力，这是由于 PXR 配体结合口袋内的氢键和疏水相互作⽤得到优化。⽤相应的酰胺类似物替换 SJB7，该类似物的亲和力提⾼了 10 倍 ，并观察到降解活性显著增强（化合物35），改变位点1苯环上的R1碳链对降解效率影响不大（36），但将位点2苯环上的R3甲基替换为甲氧基可增强所有降解参数（37），将位点 1 的R2叔丁基替换为更亲水的基团对活性没有进一步影响(38)。
PROTAC 的 PXR 结合亲和力
使用TR-FRET测量了荧光探针13或14从配体结合口袋中的位移。所有化合物的亲和力都明显比拮抗剂8 (SJPYT-331)更强，但仍能实现强效降解。在PROTAC中， 37和38具有最⾼的亲和力，这表明降解活性可能与结合亲和力部分相关。然而，38的亲和力明显⾼于37 ，同时降解效率相同，这表明降解活性并不完全归因于结合亲和力。位点 1 环的各种取代可以改变PXR结合，其中环位于埋在疏水残基之间的配体结合口袋深处。有趣的是，只需将位点 2 甲基(36)更改为甲氧基(37) 降解效率大幅提⾼，可能是因为位点 2/linker/α12界面处的相互作⽤更强。
PROTAC 降低激动剂诱导的 PXR 活性并使结肠癌细胞对化疗敏感
使⽤受CYP3A4启动子控制的萤火虫荧光素酶报告基因，发现38降低了抗生素利福平、化合物T0901317 和化疗紫杉醇对 PXR 的激活。在没有 PXR 激动剂的情况下， 38还降低了CYP3A4启动子上的基础 PXR 活性。在 SNU-C4 结肠直肠癌细胞中评估内源性CYP3A4诱导时也观察到38的抑制作⽤。重要的是， 38对 PXR 本身的 RNA 水平没有影响，尽管它在紫杉醇存在下确实降低了 PXR RNA，这可能是由于紫杉醇的细胞毒性作⽤增强。⽤紫杉醇处理 SNU-C4 细胞 72 小时，发现与38共同处理可使细胞毒作⽤增强 3.3 倍，这表明 PXR 降解与 PXR 激活药物相结合时具有潜在的治疗益处。
结论
生理解毒系统保护身体免受化学伤害，但通过促进排泄或产生可能无效或有毒的代谢物，阻碍药物的安全性和有效性。PXR 是一种药物激活的转录因子，可控制药物代谢酶和药物的表达转运蛋白是解毒机制的关键组成部分。设计的 PROTAC降低了已知化学激动剂对 PXR 的激活，从而提⾼了紫杉醇的抗癌活性。
参考文献doi: 10.1021/acs.jmedchem.4c01926
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