Phytomedicine：中药三叶青活性成分解析及其抗溃疡性结肠炎的作用机制
文摘
2024-10-23 12:03
湖南
溃疡性结肠炎（UC）是一种复发缓解型炎症性肠病（IBD），发病率呈上升趋势，开发针对UC的药物刻不容缓。三叶青（SYQ）是一种古老的中草药，具有“清热解毒”的功效。多项研究表明，SYQ叶提取物可有效抑制DSS诱导的结肠炎，然而，SYQ根茎粉末是否具有抗UC药理作用及其作用机制尚不清楚。2024 年3月22日，南通大学附属医院消化内科周国雄团队在Phytomedicine（IF=7.9）发表题为“Mechanism of Nicotiflorin in San-Ye-Qing Rhizome
for Anti-inflammatory Effect in Ulcerative Colitis”的文章，SYQ根茎提取物具有治疗UC的功效，其活性成分 Nicotiflorin 通过与p65结合并抑制NF-κB和NLRP3炎症小体的激活发挥有效的抗UC作用。![]()
研究首先利用UC小鼠模型开展实验，发现SYQ治疗后，小鼠体重、结肠长度显著恢复，结肠组织的MPO活性显著增加，血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低（图1）。![]()
此外，用DSS处理的小鼠的组织病理学评分显著增加，而给予SYQ降低了组织病理学评分，以及结肠粘液屏障的损害。免疫荧光染色证实施用SYQ时，粘附连接蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白Occludin的表达得以恢复（图2）。![]()
考虑到SYQ粉体有效的抗UC作用，作者接下来想要确定其发挥治疗作用的主要成分。通过植物化学分析以分离和鉴定SYQ的主要成分，主流程图如图3所示。将SYQ根茎粉末（5kg）进行一系列提取技术，分离并获得了9种化合物。在作者的研究中，分离并鉴定了一种新化合物，命名为SYQ-D30-1S8P2。此外，在分离的化合物中，Nicotiflorin的含量最高（图3）。![]()
使用网络药理学方法，作者从各种数据库中检索并预测了9种分离和鉴定的化合物的310个关键靶点，并从各种数据库中预测了5591个溃疡性结肠炎的关键疾病靶标，通过取交集产生185个共同靶点。GO富集分析表明这些靶标的基因功能与激酶活性、细胞因子产生、炎症反应和I-kappaB激酶/NF-kB信号传导的正调节相关，KEGG富集分析表明PI3K-Akt、TNF、Toll样受体信号通路和NF-κB信号通路高度富集。结果表明这些信号通路可能与SYQ的抗UC作用有关，鉴于NF-κB信号通路与UC炎症反应之间的密切关联，作者后续对其进行了验证（图4）。![]()
4、SYQ中的9种分离化合物在RAW264.7细胞炎症模型中的功能为了进一步验证和筛选从SYQ中分离出的9种化合物的功效，作者首先对RAW264.7细胞系进行了药物毒性测试，结果显示9种化合物均表现出极低的生物毒性。此外，通过将RAW264.7细胞与9种化合物中的每一种共孵育并添加LPS构建了细胞炎症模型，通过测量细胞上清液中NO释放的浓度，发现Nicotiflorin（SYQ分离物中最丰富的成分）表现出最有效的抑制活性。因此，作者选择它进行进一步研究（图5）。![]()
NF-κB信号通路已被确定为SYQ对抗溃疡性结肠炎的潜在靶通路。NLRP3炎症小体的启动和激活与炎症中NF-κB信号通路的激活密切相关。为了研究Nicotiflorin与NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体之间的关系，采用分子对接确定Nicotiflorin与五个核心靶标（包括 TLR4/MD2、p65、Caspase-1、NLRP3和IL-1β）的结合能，发现Nicotiflorin与上述5个靶点均有较强的结合能力，结果表明Nicotiflorin可能通过TLR4/NF-κB途径和NLRP3炎症小体的激活影响UC（图6）。![]()
图6 Nicotiflorin与TLR4、p65、Caspase-1、NLRP3和IL-1β的分子对接作者研究了Nicotiflorin和p65（NF-κB通路中的关键调节因子）是否存在相互作用。通过CETSA、DARTS以及SPR实验证实了p65是Nicotiflorin的靶蛋白。进一步通过酶活实验发现经过Nicotiflorin处理的蛋白中p65蛋白的活性显著降低，即Nicotiflorin对p65的活性有显著的抑制作用（图7）。![]()
7、Nicotiflorin通过抑制NF-κB通路和NLRP3炎症小体激活来抑制体外炎症最后作者提取小鼠BMDM并构建炎症模型，发现Nicotiflorin显著降低NF-κB p65和IκBα的磷酸化，表明Nicotiflorin对细胞炎症的抑制作用可能是通过抑制NF-κB信号通路的下游实现的。此外，IL-1β和IL-18是炎症小体激活的标志物，LPS和ATP刺激的BMDM细胞显示IL-1β和IL-18的分泌显著增加，而Nicotiflorin处理导致两种细胞因子的分泌显著下调，WB分析确认Nicotiflorin抑制炎症体相关蛋白的表达和激活。上述结果表明Nicotiflorin显著抑制NF-κB通路和NLRP3炎症小体的激活（图8）。![]()
图8 Nicotiflorin 通过抑制NF-κB激活和NLRP3炎症小体激活来抑制体外炎症该研究旨在评价SYQ根茎粉治疗UC的疗效，并对根茎粉的化学成分进行分离和表征。此外，筛选其中最有效的化合物并确定治疗UC的潜在机制。研究发现SYQ根茎粉在体内有效恢复小鼠体重，降低DAI和病理评分，下调炎症生物标志物的表达，恢复结肠长度以及结肠上皮和粘液屏障。采用HPLC从SYQ根茎粉末中分离鉴定出9个化合物。Nicotiflorin是SYQ中浓度最高的主要化合物。根据 CCK-8和NO释放测试，Nicotiflorin也是最有效的化合物。结合网络药理学预测、分子对接分析、CETSA、DARTS、SPR和酶活性测定，Nicotiflorin最终可能通过靶向p65并抑制NF-κB通路，从而减弱NLRP3炎症小体的激活来抑制炎症（图9）。![]()
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711324002290#fig0010
