Th17细胞内在谷胱甘肽线粒体IL-22轴可防止肠道炎症

IBD青年科研小组——肠道菌群代谢版块

• GSH调节的Th17细胞产生的IL-22而非IL-17，对肠道屏障完整性至关重要；

• IBD患者中的GCLC表达与肠道完整性基因表达相关；

• Gclc控制与PI3K/mTOR驱动的IL-22翻译相关的mROS和线粒体ATP生成；

• ROS清除或增加T细胞产生的IL-22使突变小鼠免于感染引起的死亡 。

柠檬酸杆菌（Citrobacterrodentium，C.rodentium）会导致小鼠出现结肠炎症状，其致病机制与人类大肠杆菌肠道病原体相同。研究人员用C.rodentium感染野生型（WT）C57BL/6小鼠并在感染后第7天（p.i.）分离结肠固有层（LP）细胞，以研究抗氧化反应。流式细胞分析（FCA）显示感染后CD4⁺T细胞中的硫醇增加（图1A），表明抗氧化能力增强。活化T细胞代谢活性增强会增加ROS的产生，这与C.rodentium感染期间T细胞的抗氧化能力增强相一致。研究人员假设LPCD4⁺T细胞会增加GSH的产生以中和感染引起的氧化应激。事实上，感染后，分选的LPCD4⁺细胞中的细胞内GSH增加（图1B）。从未感染和感染的WT小鼠中分离的LPCD4⁺细胞中的细胞质ROS水平相当（图1C），这反映了感染动物体内升高的GSH具有更优异的ROS清除能力。这促使研究人员研究GSH是否是缓冲C.rodentium感染小鼠的LPT细胞中的ROS所必需的。利用含有T细胞特异性Gclc缺失的突变小鼠株（Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠），产生了无法合成GSH的T细胞。正如预期的那样，与感染Gclc^fl/fl同窝对照相比，研究人员观察到感染的Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的LPCD4⁺细胞中的细胞内硫醇和GSH显著减少（图1D和1E）。因此，感染突变体的LPCD4⁺细胞中的细胞溶质ROS水平升高（图1F），证实GSH损失会降低感染期间的ROS缓冲能力。为了研究T细胞中GSH损失的生理后果，研究人员监测了感染C.rodentium后的同窝Cd4CreGclc^fl/fl和Gclc^fl/fl小鼠的体重。Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠在感染后第11天体重明显减轻（图1G）。超过95%的突变小鼠在感染后第20天死于感染，而对照组小鼠没有体重减轻（图1H）。虽然对照组小鼠在感染后第20天就实现了细菌清除率（以粪便C.rodentium水平衡量），但突变小鼠的细菌清除率一直稳定增加直至死亡（图1I，左）。在感染后第14天，突变小鼠粪便中的C.rodentium集落增加了105倍以上（图1I，右）。从解剖学角度来看，感染的Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠在感染后第12天结肠长度明显缩短（图1J）。感染的Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的远端结肠出现肠隐窝丢失、溃疡和肠上皮坏死，但对照组没有出现这些情况（图1K）。因此，T细胞中的Gclc消融使小鼠无法控制C.rodentium感染，导致肠道损伤和高死亡率。这些数据表明T细胞衍生的GSH在胃肠道感染期间具有保护作用。

图1 肠道固有层T细胞中的Gclc控制ROS并保护小鼠免受致命的C.rodentium菌感染

C.rodentium感染会在小鼠体内引发强烈的T细胞反应，从而确保细菌清除和存活。评估发挥作用的T细胞亚群时，研究人员发现Th22细胞（CD4⁺IL-17^-IL-22⁺）和产生IL-17但不产生IL-22的常规Th17细胞（CD4⁺IL-17⁺IL-22^-）的频率相当（图2A–2C）。然而，感染C.rodentium的Gclc^fl/fl小鼠中产生IL-17和IL-22（CD4⁺IL-17⁺IL-22⁺）Th17细胞显著增加（图2A和2D）。相比之下，产生IFN-γ但不产生IL-17的LPTh1细胞（CD4⁺IFN-γ⁺IL-17）的频率没有增加（图2E）。重要的是，IL-17⁺IL-22⁺Th17细胞在感染后绝对细胞数量增加了40倍，而传统Th17细胞、Th22细胞和Th1细胞增加了4倍，IL-17⁺IFN-γ⁺Th17细胞增加了14倍（图2F）。因此，LP对C.rodentium感染的反应主要由IL-17⁺IL-22⁺Th17细胞介导。类视黄酸孤儿受体RORγT是驱动Th17细胞分化和IL-17表达的主要转录因子（TF），而Tbet是负责Th1细胞分化和IFN-γ产生的TF。细菌驱动的结肠炎通常与Th17细胞有关，这些细胞共同表达RORγT和Tbet。在C.rodentium感染的Gclc^fl/fl小鼠的结肠LP中，Tbet⁺RORγT⁺Th17细胞以及Tbet^-RORγT⁺常规Th17细胞的频率增加，而Tbet⁺RORγT^-Th1细胞没有增加（图2G）。感染后，Tbet⁺RORγT⁺Th17细胞的总数也显着增加（图2H）。这些结果证实C.rodentium引发的Th17反应比Th1反应更强，并表明Th17亚群产生的IL-17和IL-22，在针对该病原体的T细胞反应中占主导地位。

然而，对C.rodentium感染后第7天Cd4Cre-Gclc^fl/fl和Gclc^fl/fl小鼠结肠LP中的CD4⁺T细胞亚群进行分析，结果显示突变体中传统IL-17⁺IL-22⁻、IL-17⁺IL-22⁺细胞的频率显著降低（图2I）。在感染后的Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠LP中，Tbet⁺RORγT⁺和Tbet⁻RORγT⁺Th17细胞的频率也均有所降低（图2J）。因此，Gclc的缺失对主导C.rodentium感染免疫反应的IL-17⁺IL-22⁺Th17细胞亚群产生了深刻影响，表明Gclc对于胃肠道（GI）感染后引发Th17细胞免疫反应至关重要。

图2 Gclc对C.rodentium感染期间的Th17细胞反应至关重要

尽管IL-17和IL-22是Th17细胞的标志性细胞因子，但这些介质也由第3类固有淋巴样细胞（ILC3s）共同产生。虽然大多数ILC3s不表达CD4，但淋巴组织诱导细胞（LTi）亚群却表达CD4，因此在研究人员的小鼠模型中，它们成为Cd4Cre驱动的Gclc敲除的靶标。在C.rodentium定植于盲肠期间，CD4⁺LTi细胞是肠道中IL-22的关键来源，这是先天免疫反应的一部分。为了确定LTi功能的丧失是否在感染早期对Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的表型有所贡献，研究人员通过流式细胞术分析了感染后第4天Cd4Cre-Gclc^fl/fl和Gclc^fl/fl小鼠盲肠固有层（LP）中的CD4⁺LTi细胞（Lineage-CD3-Nkp46-CD4⁺）。当研究人员在感染后第7天（此时细菌已到达结肠）检查T细胞（CD3⁺CD4⁺）和LTi细胞群时，感染后的突变体和对照小鼠中总LTi细胞以及IL-17⁺IL-22^-、IL-17^-IL-22⁺、IL-17⁺IL-22⁺LTi细胞的频率和绝对数量均相同（图3A-3C）。结肠LPLTi细胞中Gclc的敲除不影响其细胞内活性氧（ROS）水平（图3D）。因此，与Th17细胞中观察到的IL-22产生受阻不同，Gclc的缺失不会导致LPLTi细胞中的氧化应激，因此不会干扰C.rodentium感染小鼠中LTi细胞的IL-17和IL-22产生。

为了研究LTi细胞中Gclc的敲除是否被适应性免疫反应所掩盖，研究人员将Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠与Rag1^-/-小鼠杂交，生成了缺乏适应性免疫系统的Rag1^-/-Cd4Cre-Gclc^fl/fl品系。当研究人员比较疾病进程时，观察到Rag1^-/-Cd4Cre-Gclc^fl/fl和Rag1^-/-Gclc^fl/fl小鼠均出现严重体重减轻，并在感染后第15~20天死于感染（图3E和3F），这证实了适应性反应在控制晚期C.rodentium感染中的重要性。然而，在感染后第4天（此时保护主要由先天免疫细胞介导），Rag1^-/-Cd4Cre-Gclc^fl/fl和Rag1^-/-Gclc^fl/fl小鼠在存活率、体重减轻或粪便细菌载量方面没有观察到差异（图3E-3G）。此外，感染后第7天结肠的外观和长度也相似（图3H）。因此，Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的先天反应是完整的，它们对C.rodentium感染的易感性是由于缺乏T细胞功能。

图3 LTi细胞中Gclc的缺失不会影响细胞因子的产生或对C.rodentium的反应

由于IL-17⁺IL-22⁺Th17细胞在感染的Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的结肠LP中大大减少，研究人员假设Th17细胞衍生的IL-22的缺失导致了它们的高死亡率。为了支持这一观点，用对照Fc治疗的感染突变小鼠出现严重体重减轻和100%死亡率，而重组IL-22-Fc治疗完全防止了体重减轻并完全恢复了生存率（图4A和4B）。令人惊讶的是，IL-22-Fc治疗还阻止了对照Fc治疗的Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠中观察到的肠道溃疡和隐窝消失（图4C）。因此，研究人员推测，由于感染突变体LP中Gclc缺陷型T细胞产生的IL-22非常少，因此引发了全身效应，导致死亡。

IL-22参与影响抗菌免疫的许多途径，包括影响病原体毒力的途径。然而，研究人员观察到研究人员未在此途径观察到感染的突变小鼠与对照组的差异。IL-22也与肠道屏障完整性和通透性有关。与对照组相比，感染突变小鼠的异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖从肠腔渗透到血浆中显著增强。IL-22-Fc治疗可防止肠道通透性的增加，表明肠道层完整性增加（图4D）。到感染后第12天，研究人员检测到感染的Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的血液、脾脏和肝脏中细菌滴度较高，而感染的对照小鼠的细菌负担小（图4E）。同样，IL-22-Fc治疗感染的突变小鼠将其细菌负荷降低至对照水平（图4E）。这些数据表明Gclc依赖性调节T细胞内在IL-22产生的机制可保护肠道完整性并防止细菌从肠腔扩散到外周。

图4 IL-22回补可挽救T细胞特异性GSH缺陷的小鼠免受致命的C.rodentium感染，并防止肠道通透性增加

IL-22通过调节紧密连接蛋白（如claudins）的表达和细胞内位置来促进肠道完整性。有效的紧密连接对于C.rodentium的免疫反应很重要。与感染Gclc^fl/fl小鼠的结肠相比，感染第12天的Cd4Cre-Gclc^fl/fl的远端结肠切片显示claudin-2、claudin-3和claudin-15蛋白水平较低（图5A）。此外，结肠隐窝横截面的免疫荧光显微镜检查显示感染Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的claudin-2定位异常弥散（图5B和5C）。IL-22-Fc治疗后，感染的Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠结肠隐窝中claudin-2的正确定位以及正常管腔直径完全恢复（图5B和5C）。IL-22的另一个关键功能是促进肠杯状细胞产生黏蛋白。含黏蛋白的黏液层保护肠上皮免受肠内容物侵害对于小鼠C.rodentium感染下的存活至关重要。黏蛋白（MUC2）是肠黏液层的主要成分，在结肠中最丰富。研究人员对肠隐窝的横截面进行了免疫荧光显微镜检查，并观察到感染Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的IEC中的MUC2在感染后第12天（即IL-22-Fc治疗）大幅减少（图5D）。远端结肠横切面的阿利新蓝染色显示感染Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的结肠中总管腔黏液和粘附黏液层急剧减少（图5E）。此外，在接受对照Fc治疗的Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠中，结肠IEC内储存的黏蛋白量较低，尤其是在溃疡部位，但在注射IL-22-Fc后，感染突变小鼠的黏蛋白量再次恢复正常（图5E）。这些数据表明，T细胞内在GSH合成和IL-22产生之间存在一个关键轴，这对于肠上皮屏障的保护功能必不可少。

上述结果促使研究人员研究GCLC表达是否与IBD患者的肠道完整性有关。利用溃疡性结肠炎（UC）患者直肠活检的公开RNA测序数据集（GEO:GSE109142），研究人员根据GCLC表达对患者进行分层。在中度或重度疾病患者中，研究人员发现GCLC表达与CLDN15（claudin-15）和CLND2（claudin-2）的表达呈正相关（图5F）。在轻度或中度疾病患者中，MUC2表达与GCLC呈正相关；重度病理患者同样显示出正斜率，但相关性不显著（图5F）。与小鼠结果一致，这进一步支持了研究人员的假设，即Gclc表达在预防肠道病理方面起着关键作用。在小鼠模型中，IL-17和IL-22（主要由Th17细胞产生）与claudins和mucins产生的调节有关。为了在人类环境中研究这种关系。研究人员定义了Th17细胞基因表达特征，并观察到中度或重度病理患者的CLDN15、CLND2和MUC2水平呈强正相关（图5G）。因此，这些结果表明Th17相关基因的表达与IBD患者的肠上皮完整性之间存在联系。此外，在IBD患者中，GCLC表达与Th17基因特征评分之间存在很强的正相关性（图5H）。这些发现与研究人员的小鼠数据一致，表明IBD患者肠道中的GCLC、Th17细胞标记物和与肠道完整性相关的基因之间存在很强的相关性。

图5 Gclc缺陷与C.rodentium感染小鼠和IBD患者的肠道紧密连接和黏液缺陷有关

研究人员发现，全身注射重组IL-22-Fc可预防C.rodentium引起的Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的肠道损伤和死亡。为了证实GSH控制的T细胞IL-22产生是保护机制，研究人员通过胚胎干细胞的基因靶向生成了一种新型Cre重组酶诱导的IL-22转基因小鼠模型（IL-22^ind）。这些小鼠在Rosa26基因座中携带转基因，该转基因含有IL-22的cDNA和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因，前面是loxP侧翼的STOP盒和CAG启动子。在Cre依赖性去除STOP序列后，IL-22和EGFP可以组成性表达。为了重建IL-17的产生，研究人员使用了具有类似Cre依赖性表达对照的IL-17转基因小鼠模型。在去除STOP序列后，IL-22或IL-17A和EGFP组成性表达。为了生成具有T细胞特异性IL-22或IL-17A表达的小鼠，研究人员将IL-22^ind和IL-17A^ind小鼠与Cd4Cre小鼠杂交。然后，研究人员将IL-22^ind和IL-17A^ind小鼠与Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠杂交，以生成Cd4Cre-Gclc^fl/flIL-22^ind/+和Cd4Cre-Gclc^fl/flIL-17A^ind/+小鼠，这些小鼠分别在诱导EGFP和IL-22或IL-17A的同时进行T细胞特异性Gclc删除。这种方法将IL-22和IL-17A表达与内源性T细胞中的Gclc调节分离。在突变T细胞中转基因表达IL-22（Cd4Cre-Gclc^fl/flIL-22^ind/+）可广泛挽救这些小鼠免于致命感染结果（图6A）。当未完全保护小鼠免受感染引起的致死性时，Cd4Cre-Gclc^fl/flIL-22^ind/+显示出延长的存活率（图6A）。与IL-22相反，在突变T细胞中恢复IL-17表达不会增加生存率（图6B）。重要的是，突变T细胞中T细胞特异性表达的IL-22可防止细菌扩散到脾脏和肝脏，这与转基因表达的IL-17形成鲜明对比（图6C）。表明GSH调节的T细胞IL-22产生似乎是保护肠道免受有害细菌感染的主要因素。

为了更深入地了解GSH如何调节Th17细胞中IL-22的产生，研究人员利用了体外分化的Th17细胞。IL-6、IL-23和IL-1b同时激活Cd4Cre-Gclc^fl/fl小鼠的幼稚CD4⁺T细胞以诱导Th17细胞，从而形成一个同时产生IL-17和IL-22的Th17细胞亚群。相反，如果用IL-6和转化生长因子β（TGFβ）激活幼稚CD4⁺T细胞，则会诱导主要产生IL-17的传统Th17细胞，因为TGF-β会抑制IL-22的产生。研究发现缺乏GSH的突变Th17细胞显示细胞浆和线粒体ROS增加（图6D和6E）。在体外分化过程中添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可恢复ROS水平（图6D和6E）。积累的ROS会影响线粒体的动力学和功能。为了评估突变Th17细胞中线粒体的功能，研究人员测量了耗氧率（OCR），观察到缺乏Gclc的Th17细胞的耗氧率降低，而NAC可部分恢复（图6F和6G）。

然后，研究人员分别使用MitoTrackerGreen（MG）和MitoTrackerDeepRed（MDR）评估了线粒体质量（MM）和膜电位（MMP；指示活性）。有趣的是，突变的Th17细胞中MM急剧增加，而MMP急剧下降（图6H）。MDR/MG比率表示MMP/MM并代表线粒体容量。研究人员发现Gclc缺乏的Th17细胞中MDR/MG降低，表明线粒体容量受损（图6I）。

此外，大多数对照Gclc^fl/flTh17细胞构成MDR/MG^hi群体，而突变Th17细胞形成MDR/MG^lo群体（图6J），表明线粒体去极化和功能失调。然而，这两种效应都被NAC恢复（图6H-6J），表明这些细胞中的线粒体活性取决于ROS控制。这些结果促使研究人员研究体内ROS清除是否可以恢复突变Th17细胞的功能。因此，研究人员从C.rodentium感染前7天开始，在Cd4Cre-Gclc^fl/fl和Gclc^fl/fl小鼠的饮用水中加入NAC，并持续整个感染过程。接受NAC治疗的感染突变小鼠的死亡率大幅降低，溃疡和结肠增厚和缩短也显著减少（图6K和6L）。这表明控制T细胞内在ROS对于控制C.rodentium引起的炎症至关重要。

图6 T细胞内在的IL-22而不是IL-17表达挽救了对C.rodentium的Gclc依赖性易感性

到目前为止，研究数据表明，线粒体的动力学和活性受到Th17细胞中Gclc缺失的影响。为了进行更大规模的研究，研究人员对体外分化的Th17细胞进行了批量RNA测序。尽管突变的Th17细胞表现出氧化磷酸化（OXPHOS）降低，但编码线粒体电子传递链（ETC）亚基的大多数基因似乎显著上调（图7A）。有趣的是，仔细检查发现，线粒体编码的ETC基因被特别下调（图7A）。值得注意的是，用NAC治疗缺乏Gclc的Th17细胞可恢复所有ETC成分的表达水平，尤其是线粒体编码的基因（图7A和7B）。这强调了线粒体基因表达特别受到Th17细胞中GSH缺失和ROS积累的负面影响。

线粒体基因表达受线粒体转录因子A（TFAM）调控，而线粒体转录因子A对氧化磷酸化至关重要。与氧化磷酸化和线粒体编码的ETC基因减少一致，研究人员观察到Gclc缺乏的Th17细胞中TFAM表达减少。NAC清除ROS也恢复了这种减少（图7C）。这表明存在一个尚未被重视的反馈回路，其中线粒体呼吸控制代谢ROS的产生，ROS如果不被GSH清除，就会对TFAM、线粒体ETC基因和OXPHOS产生负面影响。与这种ROS诱导的负线粒体级联一致，在体外分化的Th17细胞中缺乏Gclc时ATP产生减少（图7D）。同样，NAC的ROS清除可以恢复细胞ATP水平（图7D）。ATP被转运出线粒体并促进许多细胞通路，特别是作为一般激酶底物的细胞信号传导。因此，低ATP浓度可以根据激酶对ATP的亲和力（Km-ATP）影响激酶活性。

研究人员想知道突变Th17细胞中ATP的减少和它们的IL-22减少是否有关联。mTOR活化途径中的上游激酶磷脂酰肌醇3-激酶d（PI3Kd）的Km-ATP相对较高（118mM），表明PI3K的完全活化需要大量的ATP。与ATP减少一致，Gclc缺乏的Th17细胞中PI3K的活化以ROS清除逆转的方式降低（图7E）。此外，PI3K的特异性抑制导致WTTh17细胞中IL-22的产生下调，表明这些途径可能存在关联（图7F）。为了研究这一点，研究人员利用笼状ATP来增强Gclc缺乏的Th17细胞中的ATP。在紫外线诱导的ATP释放后，研究人员观察到ATP浓度增加（图7G和S7G）。升高的ATP浓度导致突变Th17细胞中的PI3K活化增加（图7H）。这清楚地表明细胞ATP稀缺限制了Gclc缺乏的Th17细胞中PI3K途径的激活。有趣的是，研究人员没有观察到突变Th17细胞中IL-22编码mRNA的下调（图7I）。然而，IL-22蛋白表达主要以ROS依赖的方式受到影响，排除了该途径的转录调控（图7J）。表明ROS和PI3K依赖性翻译控制Th17细胞中的IL-22产生。PI3K可以通过PI3K/AKT/mTOR信号通路刺激蛋白质翻译。同样，AKT和mTOR的磷酸化在Gclc缺乏的Th17细胞中显著下调，但通过ROS清除恢复（图7K和7L）。mTOR不仅对宿主对C.rodentium的抵抗力至关重要，而且还调节翻译。mTOR的一个靶点是真核翻译起始因子4e结合蛋白1的翻译抑制因子（4E-BP1），该因子在磷酸化后诱导与翻译起始因子真核起始因子4E（eIF4E）分离，进而诱导蛋白质翻译。与mTOR和IL-22减少一致，Gclc缺乏的Th17细胞中的4E-BP1磷酸化减少，而ROS清除后4E-BP1磷酸化仍保持在控制水平（图7M）。研究人员假设在突变的Th17细胞中，4E-BP1磷酸化的降低可能会阻碍eIF4E的释放，从而阻止IL22的翻译。为了进行研究，研究人员用eIF4E逆转录病毒转导Gclc靶向的Th17细胞，然后用Tat-Cre处理细胞以消除转导后的Gclc（图7N）。值得注意的是，在用eIF4E转导后，IL-22蛋白表达得到恢复（图7O）。

总之，这些结果表明，Gclc缺乏的Th17细胞产生的IL-22减少与线粒体功能和ATP产生减少以及PI3K/mTOR激活减弱有关，这无法刺激4E-BP1/eIF4E驱动的蛋白质翻译。因此，ROS的生理控制对于产生IL-22的Th17细胞是必要的，而Th17细胞是胃肠道感染期间产生保护性免疫所必需的。总之，研究人员的数据揭示了T细胞内在的GSH-IL-22信号轴，它是肠道屏障完整性的基础，并且依赖于线粒体ROS的控制。

图7 Gclc将线粒体基因表达和线粒体功能与Th17细胞中的IL-22蛋白翻译联系起来

本研究使用T细胞特异性Gclc缺陷小鼠模型发现突变型小鼠Th17细胞在肠道病原体柠檬酸杆菌（C.rodentium）的刺激下产生IL-22的能力受损，从而导致细菌清除缺陷、肠道损伤加剧和高死亡率。研究结果表明，GSH调节Th17细胞中的线粒体功能和ROS，从而将线粒体活动与IL-22的翻译联系起来，对抗击胃肠道感染至关重要。本研究可能为调节人类胃肠道疾病中的Th17细胞功能提供新的治疗策略。