现有的多受体 CAR T 细胞生成方法，如多载体共转导，存在局限性，可能会增加每个细胞的载体拷贝数量，从而增加插入突变的风险。为了克服这些挑战，希望之城 (City of Hope ) 的研究人员开发一种亮氨酸拉链细胞分选系统（zip-sorting），使用免疫磁性分选原理，能够从初始共转导百分比低的异质细胞群中纯化成高比例的CAR阳性细胞群体，实现了在单一T细胞中表达多个CAR和多个“开关受体”。
以上研究发表在最新的《Nature Biomedical Engineering》期刊上，标题为：Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors。
亮氨酸拉链细胞分选系统原理：利用两种不同的基因载体，分别编码捕获拉链和分泌拉链，当两个载体都成功转导到同一个细胞中时，分泌型"亲和"拉链会在细胞内与膜结合的"捕获"拉链结合，使标签展示在细胞表面。利用抗标签磁珠可以特异性地捕获并分离出这些双转导细胞，从而实现高效的细胞纯化。甚是妙啊。
共转导和单转导 T 细胞的 VCN 随着初始转导效率的增加而增加。平均而言，共转导细胞的 VCN 大约是单转导细胞的两倍，来自最低平均预分选双转导效率（约 20%）的 Zip 分选 T 细胞的平均 VCN 为 5 ，并且通过测序表明分选的共转导 T 细胞的载体整合没有特定的染色体插入偏好。
造了个异质性白血病模型：将表达 CD19 和 CD20 的 BM185 细胞（特殊基因编辑）以 1:1 的比例混合后注射到小鼠体内，使用 Zip 分选技术从共转导的小鼠原代 T 细胞中分离出了表达 CD19 和 CD20 CAR 的双 CAR T 细胞（从29%的双CAR表达率提高到95%），还制备了表达单 CAR 的 T 细胞作为对照组回输小鼠。结果发现：双 CAR T 细胞比单 CAR T 细胞能更有效地清除白血病细胞，并显著延长小鼠的生存期，但还是有小鼠复发。
“开关”受体被设计用来将肿瘤微环境中的抑制信号转化为激活信号。它们通过将抑制受体（如 PD-1、CD200R 和 Fas）的胞外结构域与共刺激分子（如 OX40、CD27 和 4-1BB）的共刺激结构域融合来实现。
构建了表达不同“开关”受体组合的 CAR T 细胞，包括：双 CAR T 细胞：表达 CD19 和 CD20 CAR，但不表达“开关”受体。单“开关”受体 CAR T 细胞：双 CAR，以及 Fas-4-1BB “开关”受体。双“开关”受体 CAR T 细胞：双 CAR，以及 CD200R-CD27 和 PD-1-DNR “开关”受体。三“开关”受体 CAR T 细胞：双 CAR，以及 PD-1-OX40、CD200R-CD27 和 Fas-4-1BB “开关”受体。
将以上不同 CAR T 细胞注射到患有混合白血病的小鼠体内，结果发现：表达“开关”受体的 CAR T 细胞在体外和体内都表现出更强的抗肿瘤活性。在混合白血病模型中，表达“三开关”受体 (PD-1-OX40、CD200R-CD27 和 Fas-4-1BB) 的双 CAR T 细胞能够完全清除白血病细胞，并使所有小鼠长期存活。表达单“开关”受体 (Fas-4-1BB) 或不表达“开关”受体的双 CAR T 细胞组则出现了白血病复发。多“开关”受体 CAR T 细胞可能是治疗抗原异质性和免疫抑制性肿瘤的一种有希望的策略。
肿瘤抗原丢失逃逸、T 细胞持久性不足以及 T 细胞功能受损是限制 CAR T 细胞治疗实现持久缓解的三大障碍。为克服这些挑战，研究人员开发了 Zip 分选系统和多 CAR 多开关受体的工程T细胞平台。Zip 分选系统能够对共转导了两个载体的细胞进行一步免疫磁性纯化。该系统基于异二聚体亮氨酸拉链配对。
多 CAR 阵列克服了高度异质的肿瘤相关抗原表达，而多开关受体阵列则促进了 CAR T 细胞的存活和扩增。这两种设计通过结合策略来抵抗由于靶抗原异质性和多种抑制性配体的表达而引起的肿瘤免疫逃逸，从而增强了针对抗原多样性靶标的 T 细胞活性。这么多的外源基因在T细胞表达，得益于Zip分选系统。
参考文献：James, S.E., Chen, S., Ng, B.D. et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat. Biomed. Eng (2024). https://doi.org/10.1038/s41551-024-01287-3
