肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 中 CD8 T 细胞的功能障碍或衰竭是肿瘤免疫逃逸的一个主要机制。T 细胞衰竭的特点是效应功能丧失、抑制性受体上调、代谢重编程和表观遗传改变。迫切需要新的治疗策略来克服 T 细胞衰竭并增强 ICB 疗法的疗效。
近日新加坡科技局于强实验室在《Cancer Cell》期刊在线发表了题为Targeting P4HA1 promotes CD8+ T cell progenitor expansion toward immune memory and systemic anti-tumor immunity的文章确定了 P4HA1（编码脯氨酰 4-羟化酶 1）作为 CD8 T 细胞分化的关键调节因子，其在肿瘤引流淋巴结 (TDLN) 和缺氧肿瘤微环境中高度上调，抑制 P4HA1 可增强祖细胞 CD8+ T 细胞的扩增，同时减轻衰竭，从而增强全身抗肿瘤免疫。
文章解析
为了研究 CAR T 细胞激活和衰竭过程中基因表达的变化，对分离的人 CD8+ T 细胞进行了 RNA 测序分析。这些细胞经过基因工程改造以表达靶向 EGFR 的嵌合抗原受体 (CAR)，并在体外反复暴露于表达 EGFR 的 DLD1 癌细胞（图 A）。结果显示，P4HA1 在早期 T 细胞激活和重复抗原刺激下的缺氧条件下均显着上调（图 B-D）。
P4HA1+ CD8+ T 细胞的百分比随着时间的推移而增加，无论是在常氧还是缺氧条件下（图 E-F）。此外，P4HA1 的诱导与衰竭标志物 PD-1 的上调和祖细胞标志物 TCF1 的下调相关（图 E-F）。
对 DPCA（一种 P4HA1 抑制剂）处理的 CD8+ CAR T 细胞进行基因分析显示，与线粒体适应性相关的通路富集（图 A）。与 DMSO 处理的细胞相比，DPCA 处理的 CD8+ CAR T 细胞中线粒体适应性相关基因的表达上调（图 B）。WB分析和免疫荧光成像也表明，P4HA1 在静息或刺激的 CD8+ T 细胞中积累在线粒体部分（图 C-E）。
Seahorse 分析进一步证实了，DPCA 处理显着增强了 CD8+ T 细胞的基础呼吸和最大呼吸能力（图 F-G）。也就是说，P4HA1 通过破坏 TCA 循环诱导线粒体功能障碍和 T 细胞衰竭。
为了评估 P4HA1 在 CD8+ T 细胞衰竭中的作用，使用 CRISPR-Cas9 技术敲除了人 EGFR CAR T 细胞中的 P4HA1 或 PD-1。与对照或 PD-1 敲除的 CAR T 细胞相比，P4HA1 敲除导致 CAR T 细胞显着扩增（图 A）。
此外，P4HA1 敲除（而非 PD-1 敲除）增加了 CAR T 细胞中干细胞中央记忆 (Tscm) 和中央记忆 (Tcm) 细胞群，但减少了效应 (Teff) 细胞群（图 B），并增加了 TCF1+ 细胞群（图 C）。
在通过与癌细胞共培养重复进行肿瘤抗原刺激后，P4HA1 敲除导致 CAR T 细胞持续强劲扩增（图 D），而在同时敲除 PD-1 和 P4HA1 (DKO) 时，这种扩增进一步增强（图 D）。与单敲除相比，DKO 还表现出更高的多细胞因子产生和对癌细胞的细胞毒性（图 E 和 F）。
化学试剂抑制 P4HA1 或者基因KO是否可增强 CAR T 细胞的体内疗效和持久性？使用了几种 CAR T 细胞模型，Trop2 和 HER2 或者EGFR CAR T 做个了动物实验。
DPCA 处理和 P4HA1 敲除的 CAR T 细胞治疗都导致了肿瘤的完全和持久清除（图 F、G），外周血中的持久性也增加了（图 H 和 I）。相反，对照 CAR T 细胞或 PD-1 敲除的 CAR T 细胞仅能部分控制肿瘤，随后肿瘤迅速复发，血液持久性差。
在 Trop2 CAR T-MDA-MB-231 模型中，同时敲除 P4HA1 和 PD-1 (DKO) 进一步提高了长期抗肿瘤疗效（图 J ）、体内持久性（图 K）和存活率（图 L）。
此外，在 HER2 CAR T-MDA-MB-361 模型中，与对照 CAR T 细胞相比，在肿瘤中检测到显著增加的浸润性 DPCA-CAR T 细胞（图 M、N 和 O）。DPCA-CAR T 细胞还表现出 P4HA1+ 细胞群和衰竭减少，但 TCF1+ 细胞群和细胞因子表达增加（图 O）。这些体内研究结果表明，在 CAR T 细胞制备过程中，化学抑制 P4HA1 或者基因KO是可增强 CAR T 细胞的体内疗效和持久性。
利用同基因小鼠肿瘤模型研究了 DPCA 是否能在体内增强内源性 CD8+ T 细胞的活性，在手术切除肿瘤前用 DPCA、抗 PD-1 抗体 (aPD-1) 或联合用药治疗荷 4T1 肿瘤的 BALB/c 小鼠两周。单独使用 DPCA 或与 aPD-1 联用均能显著抑制肿瘤生长（图 B 和 C）。与对照组相比，DPCA 治疗（而非 aPD-1 治疗）显著降低了术后复发率（58% 对 100%）。 aPD-1单用没啥效果。
对肿瘤中 CD8+ T 细胞的分析表明，DPCA 而非 aPD-1降低了 P4HA1+ 细胞群或衰竭细胞群的数量，但增加了祖细胞衰竭细胞群的数量（图 F 和 G）。它们还增加了 CD8+ T 细胞浸润和效应细胞因子的表达（图 H），并改善了 CD8+ T 细胞的线粒体功能。
此外，DPCA 治疗还能够诱导免疫记忆能力，从而预防肿瘤复发。在未复发的小鼠中，记忆 T 细胞（Tscm 和 Tcm）占 CD8+ T 细胞总数的很大比例（高达 80%），而效应 T 细胞（Teff）只占 20%（图 K）。在再次注射 4T1 细胞后，未能形成肿瘤。
总的来说，P4HA1 是一种 α-酮戊二酸依赖的代谢酶，它利用 α-酮戊二酸作为底物，催化脯氨酸羟基化，并产生琥珀酸作为副产物。P4HA1 在 CD8+ T 细胞被激活后会显著富集并积累在线粒体中，导致线粒体中琥珀酸过度积累，破坏了 TCA 循环中 α-酮戊二酸和琥珀酸的正常代谢平衡，导致线粒体功能障碍，影响 T 细胞的能量供应和代谢，最终导致 T 细胞衰竭，降低其抗肿瘤能力。通过基因敲除和药物抑制P4HA1，在体内外均证实了其对增强T细胞活性和抗肿瘤免疫的作用。
参考文献：Ma S, Ong L T, Jiang Z, et al. Targeting P4HA1 promotes CD8+ T cell progenitor expansion toward immune memory and systemic anti-tumor immunity[J]. Cancer Cell, 2024.
