省流：最近发表在《Nature Immunology》一篇文章通过高通量筛选鉴定出三种激酶抑制剂（KIs），能够在体外和体内增强嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）的抗肿瘤活性。该疗法通过维持CAR-T细胞的干细胞样表型，特别是来自幼稚T细胞的CAR-T细胞，来实现这一目标。该KI鸡尾酒疗法能特异性靶向ITK、ADCK3、MAP3K4和CDK13等激酶，并引起转录组变化，而不抑制T细胞活化或改变染色质结构。 在小鼠肿瘤模型中验证了其疗效，并表明该疗法也适用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的CAR-T细胞生产。
对激活的人 T 细胞中激酶抑制剂 (KIs) 进行自动化高通量筛选。
●高通量筛选平台的建立：用一个 384 孔板的自动化高通量筛选平台，以 3 μM 的浓度测试了包含 810 种化合物的激酶抑制剂库 (PKIS1 和 PKIS2)。健康捐献者外周血单核细胞 (PBMCs) 中分离 T 细胞，用激动性 CD3 或 CD28 抗体刺激 5 天。高通量流式细胞术分析细胞观察 T 细胞的数量和大小的变化，以此来判断激酶抑制剂的效果。
●筛选标准与命中化合物的选择：排除了导致 T 细胞死亡或抑制 T 细胞激活和增殖的化合物，如一个激酶抑制剂让 T 细胞数量减少了超过四分之一，或者让 T 细胞的活跃程度降低了超过 30%，它也会被淘汰。筛选出 UNC10225387B、UNC10225263A 和 UNC10112761A 的三种激酶抑制剂进行深入研究。
●高通量筛选的最终结果：这三种激酶抑制剂能够抑制 T 细胞分化，并维持干细胞样 T 细胞的特性。可以阻止 T 细胞分化（从 CD45RA+ 到 CD45RO+ 的转变）、对 T 细胞活化产生最小的影响（通过 CD69 表达）并促进其扩增。这意味着这些激酶抑制剂可以用于改进 CAR-T 细胞疗法，使其更加有效地治疗癌症。
在初始 T 细胞中加入激酶抑制剂 (KIs) 可以促进 TSCM 细胞样 CAR T 细胞的生成。
●KIs 的加入时间及浓度优化：开始在 T 细胞激活、转导和扩增的起始阶段加入 3 μM 的 KIs。将 KIs 的加入时间推迟到转导后 3 天， 这种策略实现了 CAR.CD19 在 T 细胞中的稳定表达。0.75 μM 的 KI 混合物在维持 TSCM 细胞样细胞频率的同时，还能保证 CAR T 细胞的良好扩增。
●KIs 促进 TSCM 细胞样 CAR T 细胞生成：使用 0.75 μM 的 KI 混合物对更多健康捐赠者进行了验证。KI 处理组和 DMSO 处理组的 CAR 表达水平和 CD4/CD8 T 细胞比例相似，但 KI 处理组的 CD4 和 CD8 CAR.CD19 T 细胞中 CD45RA+CCR7+ 细胞的比例显著增加。KI 处理组的 CAR.CD19 T 细胞中 TCF1 蛋白和 TCF7 mRNA 的表达水平也显著增加。 这些结果表明，KI 混合物可以有效地促进 TSCM 细胞样 CAR T 细胞的生成。
●KIs 对不同 T 细胞亚群的影响：与记忆 T 细胞相比，KIs 更倾向于促进初始 T 细胞生成 TSCM 细胞样 CAR T 细胞。这表明 KIs 可能主要通过诱导初始 T 细胞分化为 TSCM 细胞样细胞，而不是维持预先存在的 TSCM 细胞来发挥作用。
经 KIs 处理的 CAR T 细胞表现出更优越的活性。
●KIs 处理的 CAR T 细胞在体外和体内均表现出增强的抗肿瘤活性：用 KI 处理的 CAR.CD19 T 细胞在与肿瘤细胞共培养时表现出更强的增殖能力。在体内异种移植 B 细胞淋巴瘤模型中，注入 KI 处理的 CAR.CD19 T 细胞的小鼠表现出更好的肿瘤控制和更长的总生存期。在 KI 处理的 CAR.CD19 T 细胞小鼠的脾脏中检测到更多的 CD4 和 CD8 CAR T 细胞，以及更多的 CD45RA+CCR7+ 细胞，这表明这些细胞在体内具有更好的持久性。
●KI 处理的 CAR T 细胞来源于初始 T 细胞的 TSCM 细胞样细胞增加，赋予其优越的抗肿瘤活性：KI 处理主要保留了来源于初始 T 细胞的 TSCM 细胞样细胞，表明 KI 可能优先诱导初始 T 细胞分化为 TSCM 细胞样细胞。TSCM 细胞样细胞是一类具有自我更新和分化潜能的记忆 T 细胞亚群，其在 CAR T 细胞治疗中的持久性和抗肿瘤活性方面起着关键作用。
KI 混合物如何靶向多种激酶以维持 TSCM 细胞样 CAR T 细胞？
●KI 混合物靶向 ZAP70 激酶：基于细胞的多重抑制剂微珠富集与质谱联用 (MIB-MS) 分析方法来检测 KIs 与 200 多种激酶的直接结合能力发现ZAP70 激酶是所有三种 KIs 的共同靶标，通过 TCR 激活 Jurkat 细胞的实验进一步验证了 ZAP70 是 KIs 的靶标。结果显示，所有三种 KIs 都降低了 ZAP70 及其下游底物 LAT 的磷酸化水平。
●多种激酶的共同抑制对维持 TSCM 细胞样 CAR T 细胞至关重要：由于 KI 混合物才能有效维持 TSCM 细胞样 CAR T 细胞，推测多个通路必须同时被靶向才能维持 TSCM 细胞样细胞。 通过 shRNA 敲低技术分别抑制了上述被三种 KIs 靶向的激酶发现：单独或组合敲低 ITK、ADCK3、MAP3K4 或 CDK13 均能增加 CD4 和 CD8 CAR T 细胞中 CD45RA+CCR7+ 细胞的比例，这与 KI 混合物处理的结果相似。然而，与 KIs 的可逆抑制作用相比，激酶的基因敲低严重损害了 CAR T 细胞的功能。
KI 混合物通过同时抑制多个激酶通路来维持 TSCM 细胞样 CAR T 细胞。KI 混合物能够可逆地靶向多个激酶，这优于单一激酶基因敲低，从而增强了 CAR T 细胞的抗肿瘤活性。
●KI混合物 对 CAR T 细胞转录组和表观遗传学的影响：KI 诱导 CAR T 细胞发生转录组改变，促进 TSCM 细胞特征基因的表达，同时抑制效应程序和促进 TSCM 细胞发育程序来调节基因表达，但不会导致 CAR T 细胞发生表观遗传学改变。也就是说KI 诱导的基因表达改变并非表观遗传重编程的结果，而是通过调节关键转录因子和信号通路来实现的。
KIs 在慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 患者样本中制备的CART细胞的能力如何？
●功能失调的 CLL 患者 T 细胞中，KIs 也能促进 TSCM 细胞样 CAR T 细胞的产生：CLL 患者的 T 细胞功能高度失调，使用来自 CLL 患者的样本进行实验。来自 CLL 样本的 T 细胞可以被有效转导以表达 CAR.CD19，并且单剂量的 KI 混合物对 T 细胞计数的影响极小。与健康供体来源的 CAR T 细胞类似，经 KI 处理的 CLL 患者来源的 CAR.CD19 T 细胞在 CD4 和 CD8 CAR T 细胞中均显示出 CD45RA+CCR7+ 细胞频率增加，并且 TCF1 蛋白表达显著更高。
●KIs 增强了 CLL 患者来源的 CAR T 细胞的抗肿瘤功能：将患者来源的 CAR.CD19 T 细胞与自体 CD19+ CLL 细胞共培养时，与 DMSO 处理的 CAR T 细胞相比，KI 处理的 CAR T 细胞释放了更多的 IL-2，并在重复共培养实验中显示出 更高的增殖能力。在 Daudi 淋巴瘤小鼠肿瘤模型中， KI 处理的 CLL 患者来源的 CAR.CD19 T 细胞也显示出优异的体内抗肿瘤活性。
总之，KI 混合物可以在 CLL 患者的 CAR T 细胞制备过程中使用，以提高 TSCM 细胞样细胞的频率并增强其抗肿瘤活性，为 CLL 患者的 CAR T 细胞治疗提供新的策略。
针对实体瘤，在神经母细胞瘤模型中也观察到 KI 处理的 CAR T 细胞具有增强的抗肿瘤活性。
参考文献：Song, F., Tsahouridis, O., Stucchi, S. et al. A multi-kinase inhibitor screen identifies inhibitors preserving stem-cell-like chimeric antigen receptor T cells. Nat Immunol (2025). https://doi.org/10.1038/s41590-024-02042-1
