![]()
在LFIA信号增强策略的开发上，许多研究都致力于通过酶促化学反应来实现信号放大，利用酶在AuNPs表面的活性将底物转化为有色产物，例如辣根过氧化物酶（HRP）对3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的催化已实现应用。然而，天然酶的使用有严重的缺点，如稳定性低、活性易丧失、环境耐受性低。人工金属酶Mimochromes （MCs）通过小型化方法和迭代设计改造成用于催化的最佳骨架MC6*a。MC6*a可以容纳多种金属离子，其Fe（III）配合物是一种高活性的过氧化物酶，在2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）氧化中显示出比HRP高20倍的催化效率，这为替代HRP用于增强LFIA信号成为可能。1 AuNPs@dAb@FeMC6*a的制备与表征通过柠檬酸钠还原法制备出AuNPs，平均直径15.9±0.8 nm，随后吸附上FeMC6*a和山羊抗人IgG（dAb），并进行条件优化。根据聚沉试验筛选的结果，以最大吸光度差异的最小值筛选出1mL AuNPs原液中FeMC6*a和dAb用量分别为0.65µg 和5.85µg，封闭液为1%的PEG-400，pH为7（图1A-C），复溶液（PBS 10 mM、pH 7.4、5%蔗糖、1% PEG-400、0.5%吐温20）复溶重悬。与山羊抗人IgG和HRP标记的AuNPs（AuNPs@dAb@HRP）以及仅含有山羊抗人IgG标记的AuNPs（AuNPs@dAb）进行比较，吸收光谱表明，三者均能达到稳定状态（图2A-C）。透射电镜扫描和UranyLess染色结果显示金核周围存在蛋白质以及没有聚集物的生成（图3）。
图1 抗体/酶用量、包被液、pH条件优化 (A)pH 7; (B)pH 8; (C)pH 9![]()
图2 UV-vis光谱 (A)AuNPs@dAb@FeMC6*
a; (B)AuNPs@dAb@HRP; (C)AuNPs@dAb![]()
图3 TEM图像和尺寸分布直方图 图4 添加TMB金标垫显色变化为了评估FeMC6*a在LFIA技术中作为天然酶替代品的潜力，研究了其对H2O2介导的TMB氧化的催化活性，并与HRP的催化活性进行比较（表1）。在层析过程中，金标探针通常会经历干燥再湿润的流程，金标垫在真空下干燥再湿润后没有出现聚集（金标垫没有变成紫色），TMB溶液加入到垫中，用PBS再湿，可以观察到颜色从红色到深紫色的变化，从而证明在人工FeMC6*a过氧化物酶的催化下，显色底物被成功氧化（图4）。![]()
比较了AuNPs@dAb、AuNPs@dAb@HRP、AuNPs@dAb@FeMC6*a三者的LFIAs性能。用AuNPs@dAb制备的试纸条检出限为30.5±1.9 ng/mL；用AuNPs@dAb@HRP制备的试纸条检出限为37.4 ± 1.6 ng/mL，加入TMB底物后，检测限为18.2 ± 0.9 ng/mL；用AuNPs@dAb@FeMC6*a制备的试纸条检出限为36.4±1.4 ng/mL，加入TMB底物后，检测限为8.2 ± 1.2 ng/mL（表2）。由此可见使用FeMC6*a催化后检测限较传统方法提高近4倍，较HRP催化方法提高2倍多。![]()
表2 不同标记物的金标探针检测限
4 稳定性检测
为了评估LFIA的长期稳定性，将试纸条在室温下保存4周。在第0、3、7、15和30天进行检测。第15天信号强度开始下降（图5A-B）。在添加TMB底物后的检测发现，信号强度在30天内始终能保持在较高水准，说明FeMC6*a的活性不会丢失，较为稳定（图5C-D）。图5 不同标记物金标探针的LFIA检测限 (A-B)未添加TMB; (C-D)添加TMB
【总结】
在本文中，研究人员将合成的小型过氧化酶FeMC6*a整合到LFIA装置中。暴漏在AuNPs表面的FeMC6*a催化TMB底物氧化成不溶性有色底物，增强显色的信号强度，较传统方法灵敏度提高近4倍。FeMC6*a的酶活性能够在LFIA实验中不同的环境中保持，不会干扰检测抗体对靶标抗原的捕获，与HRP相比，FeMC6*a具有更好的催化活性，灵敏度提高近2倍。稳定性试验证明FeMC6*a的试纸条在室温下可稳定长达一个月。
原文链接：An Artificial Miniaturized Peroxidase for Signal Amplification in Lateral Flow Immunoassays.
DOI: 10.1002/smll.202207949
指导教师：王战辉
抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展，欢迎投稿！
点击下方，轻松关注！
