![]()
【研究简介】
基于抗原抗体特异性识别的免疫分析具有快速、经济、灵敏和特异等优点，被广泛应用于生物医学、药物开发、环境监测、食品分析及安全监测等领域。免疫分析检测时通常需要使用甲醇等有机溶剂从生物和环境样品中提取靶标物，以确保免疫分析的灵敏度和精密度，但引入的有机溶剂会破坏抗体的稳定性与结合活性，进而损失免疫分析性能，因此设计开发能在有机溶剂中保持结合活性的耐受性抗体是解决这一问题的重要方向。目前开发耐受性抗体的策略主要为压力筛选和抗体工程，然而由于抗体在甲醇等有机溶剂中的耐受机制尚不明确，限制了这两种策略在有机溶剂耐受性抗体的发现与设计中的应用价值。鉴于此，本研究以25株靶向非甾体类抗炎药的单克隆抗体和甲醇为模型，测定了抗体的甲醇耐受性并发现了具有显著规律性的两种抗体甲醇效应模式：“谷-峰”和“峰”模式，基于结构分析提出了两种效应模式的“折叠-聚集”假设，并通过MD模拟进一步验证这一假设，最后阐明了两种效应模式的序列基础。本研究首次揭示了抗体甲醇效应模式和相关分子机制，对耐受性抗体的发现和工程化开发具有重要意义。【内容介绍】
1、抗体甲醇耐受性的测定
以25株靶向非甾体类抗炎药的单克隆抗体为研究对象，通过非竞争ELISA（ncELISA）测定25株抗体在不同浓度甲醇下与包被抗原的结合活性，绘制抗体的甲醇耐受性曲线，较低的OD值表明抗体在该甲醇浓度下的结合活性降低。结果显示，25株抗体的耐受性曲线呈现明显的规律性，可分为两种甲醇效应模式（图1）。第一种模式为“谷-峰”模式（模式1），随着甲醇浓度升高，抗体结合活性先下降后上升，最后下降，其特征为明显的谷值和峰值（图1A）；第二种模式为“峰”模式（模式2），抗体结合活性先上升后下降，仅有峰值（图1B）。其中14株抗体属于“谷-峰”模式，而剩余11株属于“峰”模式。模式1抗体在甲醇浓度约为30%时结合活性达到谷值，在约50%甲醇时达到峰值；而模式2抗体结合活性在约30%甲醇时达到峰值，之后结合活性迅速下降。当甲醇浓度超过50%时，两种模式的抗体结合活性均急剧下降，甲醇浓度高于80%时，抗体结合活性几乎完全丧失。为了验证抗体耐受性规律的普遍性，对已报道抗体的耐受性曲线进行比较分析，发现这两种甲醇效应模式普遍存在于已报道的鼠源、兔源和驼源抗体中。![]()
图1. 抗体的甲醇耐受效应模式（A）“谷-峰”模式曲线抗体结合活性先下降，然后上升，最后下降，（B）“峰”模式曲线抗体结合活性先上升，然后下降。通过ncELISA测定不同浓度甲醇下抗体与包被抗原的结合活性。
2、甲醇中抗体二级结构的测定
为了深入研究两种甲醇耐受效应模式的内在机制，选择MAA特异性抗体3B3（模式1）和TLF特异性抗体3B4（模式2）作为两种效应模式的抗体代表，使用圆二色光谱（CD）测定不同浓度甲醇下3B3和3B4的二级结构变化。如图2B和2D所示，3B3和3B4两种效应模式抗体的二级结构类型和比例在不同浓度甲醇（0%、30%、50%和80%）下保持相对稳定，甲醇并没有显著改变抗体的二级结构。然而，不同浓度甲醇下3B3和3B4的CD信号强度存在显著差异（图2A和2C），表明抗体空间结构发生改变，有必要进一步研究甲醇下的抗体结构变化。![]()
图2. 甲醇中的抗体二级结构分析。3B3在0%、30%、50%和80%甲醇中的（A）CD谱图和（B）二级结构的百分比。3B4在0%、30%、50%和80%甲醇中的（C）CD谱图和（D）二级结构的百分比。
3、甲醇中抗体折叠和聚集的测定
为了进一步研究两种甲醇耐受效应模式的结构基础，使用差示扫描荧光（DSF）和静态光散射（SLS）分析3B3和3B4在0%、30%和50%甲醇浓度下的折叠和聚集行为。如图3A所示，模式1抗体3B3在30%甲醇中的BCM值比在0%甲醇中的BCM值显著降低，表明3B3在30%甲醇中具有更紧凑的构象，当甲醇浓度从0%增加到30%时，甲醇诱导3B3发生再折叠。然而，3B3的SLS信号值在0%和30%甲醇中均保持较低水平（图3B），表明甲醇对3B3的聚集行为没有显著影响。因此，推测3B3在30%甲醇中再折叠形成的紧凑构象破坏了抗体与包被抗原的相互作用，导致30%甲醇中3B3抗体的结合活性最低。与30%甲醇中相比，3B3在50%甲醇中的BCM值（图3A）略有下降，表明甲醇诱导3B3进一步发生再折叠，而SLS信号值在50%甲醇中则显著增加（图3B），表明当甲醇浓度从30%增加到50%时，甲醇诱导3B3抗体发生明显聚集，聚集体的形成可能增强抗体与包被抗原的结合亲合力，弥补了再折叠导致的结合活性损失，因此在50%甲醇中出现结合活性峰值。因此，可以发现3B3在甲醇中的耐受性与抗体的再折叠和聚集行为相关，概括为“折叠不利 聚集有利”。模式2抗体3B4在30%甲醇中的BCM值比在0%甲醇中的BCM值显著降低（图3C），表明当甲醇浓度从0%增加到30%时，甲醇诱导3B4发生再折叠形成更紧凑的构象，而SLS结果表明30%甲醇对3B4的聚集行为没有显著影响（图3D）。因此，推测3B4在30%甲醇中再折叠形成的紧凑构象有利于抗体与包被抗原的相互作用，导致在30%甲醇中出现结合活性峰值。与30%甲醇相比，3B4在50%甲醇中的BCM值和SLS信号值（图3C和3D）均增加，表明抗体发生去折叠和明显聚集，当抗体可变区折叠成聚集体时，这种聚集将显著降低抗体与抗原结合的机会，最终表现为50%甲醇中抗体结合活性降低。因此，可以发现3B4在甲醇中的耐受性可以概括为“折叠有利 聚集不利”。基于上述抗体折叠和聚集研究，提出两种甲醇耐受效应模式的“折叠-聚集”假设。![]()
图3. 甲醇中3B3和3B4折叠和聚集行为分析。3B3在0%、30%和50%甲醇中的（A）DSF和（B）SLS分析。3B4在0%、30%和50%甲醇中的（C）DSF和（D）SLS分析。黄点、绿色方块和紫色三角形分别代表抗体在0%、30%和50%甲醇中的折叠和聚集行为。
4、分子动力学模拟验证“折叠-聚集”假设
为了验证“折叠-聚集”假设，对3B3和3B4抗体在不同浓度甲醇中与其配体的结合进行了MD模拟。首先获得抗体可变区序列，然后基于DS软件构建抗体可变区三维结构，通过分子对接获得3B3-MAA和3B4-TLF的复合物，最后使用GROMACS在0%、30%和50%甲醇中进行100 ns MD模拟。如图4A和4B所示，3B3抗体结合腔在0%、30%和50%甲醇中的平均回旋半径（Rg）分别为1.009、0.977和0.967 nm，表明随着甲醇浓度的增加，3B3的结合腔发生再折叠，与DSF观察到的再折叠过程一致（图3A）。此外，在不同浓度甲醇中的结合自由能变化趋势（图4B）与3B3的耐受曲线一致，表现为结合活性先下降再上升（图1A）。相互作用分析表明，在0％甲醇中，MAA配体与3B3的Tyr38A和Tyr110B形成两个氢键，而在30％和50％甲醇中，仅与Tyr38A形成1个氢键（图4C），表明甲醇破坏了3B3和MAA配体的相互作用。值得注意的是，3B3在0%和50%甲醇中相当的结合活性可能是由于再折叠导致的抗体亲和力降低和聚集导致的抗体亲合力增加共同作用。因此，MD模拟结果支持将3B3分类为“折叠不利 聚集有利”的抗体类型。![]()
图4. 甲醇中3B3与MAA配体的MD模拟。（A、B）3B3在0%、30%和50%甲醇中的平均回旋半径和结合自由能，（C）3B3在0%、30%和50%甲醇中与MAA配体的复合物结构和2D相互作用。如图5A和5B所示，Rg分析表明3B4抗体的结合腔在30%甲醇中更紧凑，而在50%甲醇中更松散，与DSF观察到的折叠过程一致（图3C）。此外，在不同浓度甲醇中的结合自由能变化趋势（图5B）与3B4的耐受曲线一致，表现为结合活性先上升再下降（图1B）。相互作用分析表明，疏水相互作用在3B4和TLF配体之间的结合中占主导地位（图5C），具体而言，在0％甲醇中3B4的5个残基与配体形成疏水相互作用，而在30%和50%甲醇中分别有6个和2个残基与配体形成相互作用，表明疏水相互作用在30%甲醇中增强，但在50%甲醇中减弱。因此，MD模拟结果支持将3B4分类为“折叠有利 聚集不利”的抗体类型。![]()
图5. 甲醇中3B4与TLF配体的MD模拟。（A、B）3B4在0%、30%和50%甲醇中的平均回旋半径和结合自由能，（C）3B4在0%、30%和50%甲醇中与TLF配体的复合物结构和2D相互作用。上述结果表明“折叠-聚集”假设通过MD模拟得到了很好的验证。此外，本研究还探讨了甲醇效应模式与配体理化性质之间的关系，发现模式1和模式2抗体分布比例与配体的cLogP值和氢键供体之间存在显著的负相关，表明不同的甲醇效应模式与配体的疏水性和氢键供体密切相关，为影响甲醇中抗体耐受性的因素提供了有价值的见解。5、两类抗体甲醇效应模式的序列基础
对25株抗体的重链和轻链型比较分析，以及重链和轻链恒定区序列比对，结果显示两种效应模式与抗体亚型和恒定区序列没有相关性，提示抗体对甲醇耐受性的序列基础主要位于抗体可变区内。对25株抗体的可变区进行序列比对，发现模式1和模式2抗体重链的组内一致性值分别为0.516和0.541，均高于两种模式之间观察到的一致性值0.497（表1），表明两种甲醇效应模式的分类可能具有重链可变区的序列基础。抗体重链和轻链CDR是抗体结合腔的关键组成部分，虽然CDR长度在两种模式之间没有显著差异，但CDR残基组成具有明显的差异。具体而言，与模式2抗体相比，模式1抗体CDRH3内的小分子氨基酸（如Val）含量较高，CDRL3中脂肪族和芳香族残基显著富集，非极性氨基酸含量明显更高，CDRL1中也发现了类似规律（图6A），这些氨基酸组成差异表明模式1抗体的结合腔更疏水，而模式2抗体的结合腔更亲水。当抗体处于聚集状态时，疏水性CDR可能有助于维持甚至增强结合活性；相反，亲水性的CDR可能会显著降低抗体结合活性。表1. 两种模式抗体内部和之间的序列一致性分析
![]()
图6. 不同甲醇效应模式的序列基础。（A）模式1和模式2抗体CDR的残基分析，（B）模式1和模式2抗体LBR的残基分析。P1，模式1抗体；P2，模式2抗体。（C）3B3-GL和3B4-GL与3B3和3B4在甲醇中的耐受性曲线比较。除了抗体CDR外，配体结合残基（LBR）在决定抗体的甲醇效应模式中可能也发挥关键作用。对剩余23株抗体进行建模，并对接各自配体，结果显示模式1和模式2抗体的LBR中非极性氨基酸含量均超过50%，疏水作用力是主要相互作用力类型。具体到LBR中残基类型，两种效应模式抗体则存在显著差异，模式1抗体表现出较高水平的芳香族残基（如Trp和Tyr），提供疏水作用力和氢键相互作用，而模式2抗体脂肪族残基含量较高（Ile）（图6B）。此外，72.3%的LBR由胚系编码（表2粗体所示），表明抗体的两种甲醇效应模式可能由其胚系抗体（GL）决定。通过HEK293细胞表达3B3和3B4的胚系抗体3B3-GL和3B4-GL，通过建立抗体稀释曲线和竞争性ELISA验证了3B3-GL和3B4-GL的成功表达。随后，通过ncELISA测定3B3-GL和3B4-GL在不同浓度甲醇下与包被抗原的结合活性，绘制甲醇耐受性曲线。如图6C所示，胚系抗体表现出与对应成熟抗体相似的甲醇耐受效应模式，表明胚系抗体在决定抗体的甲醇效应模式中发挥至关重要的作用。表2. 25株NSAID抗体的配体结合残基（LBR）![]()
本研究测定了25株抗体的甲醇耐受性曲线，发现了具有显著规律性的两类抗体甲醇效应模式：“谷-峰”模式和“峰”模式。通过一系列光谱学方法研究了两类甲醇效应模式的结构基础，发现与抗体的折叠和聚集行为相关。首次提出甲醇效应的“折叠-聚集”假设，并通过MD模拟验证了这一假设。此外，序列分析表明两类效应模式抗体CDR和LBR残基类型存在显著差异，且胚系抗体决定着成熟抗体的甲醇效应模式。总之，本研究首次揭示了抗体不同甲醇效应模式的结构和序列基础，为耐受性抗体的发现和工程化设计以及有机溶剂耐受性免疫分析的开发提供了潜在的应用价值。Zhang, Y., Mi, J., Wu, W., Fei, J., Lv, B., Yu, X., ... & Wang, Z.
(2024). Investigation of Antibody Tolerance in Methanol for Analytical
Purposes: Methanol Effect Patterns and Molecular Mechanisms. Advanced Science,
2402050.原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202402050抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展，欢迎投稿！
