【研究背景】
在检测小分子化合物时，相较于传统基于T线抗原与靶标竞争结合的竞争型侧流层析免疫分析方法（LFIA），猝灭型LFIA的检测信号随靶标分析物浓度的增加而增强，可显著提高检测体系的灵敏度。猝灭型LFIA的原理主要基于内滤光（IFE）和辐射能量转移（RET）。其中，RET是一种发生在能量供体与能量受体之间的偶极-偶极相互作用，常见的RET机制主要包括荧光共振能量转移（FRET）和表面共振能量转移（NSET）。FRET的能量供体/受体的距离是指供体到受体中心的距离，一般小于10 nm；而NSET的能量供体/受体的距离是指供体到金属纳米表面，能量受体常常被当作是一个由无数个点偶极子组成的金属平面，供体/受体的距离不受能量受体直径大小的影响。
然而，基于NSET的LFIA鲜有报道，且影响该检测体系的关键因素尚不清楚。因此，本研究以广泛存在于农业作物和动物饲料且对人畜具有严重危害的T2毒素为检测靶标，制备了3种分别为530、570和610nm的量子点微球（QDMs），并与T2抗原结合作为供体（QDM-T2-BSA）。制备了9种吸收范围在520 - 605 nm的金纳米粒子（GNPs），用抗T2毒素单克隆抗体标记制备受体（GNP-mAb），构建了27种基于NEST原理的LFIA，阐明不同供体的发射光谱与受体的吸收光谱之间的重叠积分面积对荧光猝灭效率的影响规律，以构建高灵敏度的LFIA，为小分子化合物的高灵敏检测提供一定的技术手段。
图1 基于GNP-mAb/QDM-T2-BSA光谱重叠荧光猝灭检测T2的NSET-LFIA原理图。
【研究内容】
1. 供体与受体的制备与表征
15 nm-36 nm的胶体金纳米粒子（GNPs）由柠檬酸钠还原法制备，40 nm-117 nm的GNPs由种子生长法制备，经紫外分光光度计表征，所对应的最大吸收波长分别为520 nm、530 nm、540 nm、550 nm、563 nm、573 nm、585 nm、590 nm 和 605 nm。
此外，由于在RET-LFIA系统中，抗原-抗体反应通常不充分，需大量抗原和抗体进行显色，而直径在2~4 nm之间的偶联的量子点具有较小的表面积，导致不能有效呈递抗原以供抗体识别，进而导致读值信号不清晰。为了解决这一问题，本研究将具有核壳结构的高质量CdSe/ZnS量子点包覆SiO2形成QDMs，并与T2-BSA偶联制备供体QDM-T2-BSA。
图2. GNPs和QDM的表征/受体吸收光谱(实线)和供体发射光谱(虚线)。
2. 荧光猝灭机理的验证
荧光猝灭效应主要有IFE和RET两种机制，为了确定在均相溶液中哪种机制占据主导地位，本研究进行了详细探讨。RET的判断标准是猝灭剂与荧光强度的线性关系以及荧光寿命的变化。实验结果表明，随着GNP-605-mAb的用量增加，QDM-610-T2-BSA的荧光信号显著降低，表明两者之间成功发生了RET。此外，QDM-610-T2-BSA与GNP-605-BSA的荧光强度呈线性关系，斜率为27.81，而QDM-610-T2-BSA与GNP-605-BSA的斜率为10.01，证实了GNP-605-mAb与QDM-610-T2-BSA之间存在RET。
在LFIA中，通过扫描电镜进一步证实了GNP-mAb和QDM-T2-BSA之间存在能量转移。理论上，在NSET-LFIA体系中，在T2缺失的情况下，GNP-mAb可以直接与T线上的QDM-T2-BSA结合，导致能量转移。图3显示，只有红色箭头标记的QDM-T2-BSA附着在NC膜上，GNP-mAb没有附着在QDM-T2-BSA表面，导致能量转移不成功。这些结果表明，在建立的NSET-LFIA系统中，GNP-mAb和QDM-T2-BSA之间可以发生能量转移。
图3 NSET-LFIA条带膜照片、荧光和扫描电镜图像（红色箭头代表在T线上捕获的QDM-T2-BSA球体，蓝色箭头代表在T线上捕获的GNP-mAb球体）
3. 光谱重叠与荧光猝灭效率的关系
随后，本研究配对了9种GNPs与3种QDMs，形成了27种不同的组合，并测量了其荧光猝灭效率。实验发现，当GNPs的吸收光谱与QDMs的发射光谱重叠面积较大时，猝灭效率显著提高。例如，GNP-605-mAb与QDM-610-T2-BSA的组合具有最大重叠面积，猝灭效率达到91.0%。这些结果表明光谱重叠面积是影响荧光猝灭效率的关键因素，即通过选择合适的吸光度和发射波长的供体-受体对，使重叠积分面积最大，可以实现有效的NSET。
图4 基于不同供体-受体组合的NSET-LFIAs标准曲线/NSET-LFIA的重叠积分面积与猝灭效率和qLOD的关系
4. 小分子NSET-LFIA体系的构建
在阐述了重叠积分区域与荧光猝灭效率之间的关系后，将NSET系统与LFIA耦合，用于检测样品中的T2毒素。本研究基于27种供体-受体组合建立了最佳条件下的NSET-LFIA，研究结果表明，更大的重叠积分面积有助于提高荧光猝灭效率和检测灵敏度。显然，通过增加供体和受体之间的重叠积分面积，可以进一步提高NSET-LFIA系统的检测灵敏度。这些结果验证了关于重叠积分面积与荧光猝灭效率之间关系的假设，为NSET-LFIA检测系统的设计提供了一定支撑。最终，本研究采用检测灵敏度最佳的GNP-605-mAb和QDM-610-T2-BSA的组合，其IC50值为0.24 ng/mL，其灵敏度分别是常规LFIA、IFE-LFIA和ELISA的10倍、8倍和2.5倍。
最后，基于该组合的NSET-LFIA成功应用于玉米样品中T2的检测，加标回收率为90.20% ~ 109.53%，玉米样品中的LOD为1.28 μg/kg。此外，真实自然污染的玉米样品与HPLC-MS/MS比对结果表明，基于NEST的LFIA灵敏度良好且操作简便，为食品安全中小分子残留的快速监测提供了强有力的现场筛选工具。
【原文出处】
Mingyue Ding, Leina Dou, Tong Bu, Zizhe Li, Yexuan Mao, Meng Dang, Xianqing Huang, Lianjun Song, Zhanhui Wang, Xiya Zhang. Nanometal surface energy transfer-based lateral flow immunoassay for T2 toxin detection. Biosensors and Bioelectronics, 2025. 116779.
https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116779.
指导老师：王战辉
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