Microchim Acta：基于Au@Pt纳米酶的比色/荧光免疫传感器灵敏检测吡虫啉

摘要：本研究制备了高催化活性和高稳定性的金铂（Au@Pt）纳米酶，基于其对3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB）的催化活性建立了比色/荧光双模式信号输出的ELISA方法，并利用此方法对不同蔬菜样品中吡虫啉（IMI）残留进行检测。吡虫啉在比色法和荧光法中的检出限分别为0.88 μg/L和1.14 μg/L。本研究利用的多模式策略使得对吡虫啉残留的ELISA检测更为灵敏、灵活、准确可靠，具有一定的实用价值。

酶联免疫吸附试验（ELISA）作为农药残留检测中最常用的方法之一，具有高特异性和高效率的优点。然而，ELISA中的天然酶容易失活、成本高、制备过程复杂。具有环境耐受性强、制备工艺简单、成本低、光学性质好、催化活性高等优势的纳米酶正逐渐成为生物酶的替代物。大多数基于纳米酶的ELISA是利用纳米酶的高催化活性来获得单一的分析结果。这种单信号ELISA方法容易受到限制，因为其依赖于非标准化的分析方案，这些方案在程序和一致性方面可能会有所不同，所用实验设备在质量和性能方面也可能会有所不同。为了进一步获得更准确的定量结果，需要拓宽ELISA的检测模式。基于纳米酶的多模式ELISA充分利用了纳米酶的催化特性，可实现多模式信号输出。其优势包括：纳米酶具有环境耐受性及高催化活性，能够进行高性能分析；多信号检测模式提供多个信号输出，不同信号的结果可以相互印证，以提高结果的可靠性；多信号检测模式提供了更多的检测设备和工作条件的选择，进一步提高了方法的灵活性。

金-铂纳米颗粒（Au@Pt）由于具有良好的催化性质、光学性质和抗体结合能力而广泛用于ELISA 。本研究开发了一种基于Au@Pt纳米酶的具有比色和荧光信号输出模式的双模式ELISA。其中Au@Pt良好的过氧化物酶性质可以催化TMB显色并改善比色性能，且其催化得到的oxTMB具有荧光淬灭能力。所建立方法的原理为：吡虫啉与96孔板上的OVA-半抗原竞争Au@Pt偶联的单克隆抗体（mAb），当吡虫啉浓度升高时，Au@Pt-mAb与OVA-半抗原的结合减少，进而产生相应信号；其中比色信号强度与吡虫啉浓度呈负相关，荧光信号强度与吡虫啉浓度呈正相关。此外，本文还对所建立方法的灵敏度和准确性等进行了评价。    

1、Au@ Pt纳米颗粒的制备及活性鉴定

通过种子生长法制备Au@ Pt纳米颗粒，并进一步制备Au@Pt纳米球。其透射电子显微镜（TEM）图像（图1A-D）、动态光散射（DLS）分析结果（图1E-F）及能量色散光谱（EDS）图等（图1G）表征证实了Au@Pt信号标记物的成功合成。

为了确定Au@Pt的氧化酶/过氧化物酶活性（POD），在存在/不存在H₂O₂的条件下测定其催化TMB生成蓝色oxTMB的紫外吸光度并比较酶活性。结果表明，存在H₂O₂的体系（Au@Pt + TMB + H₂O₂）在652 nm处的紫外吸光度显著高于另一体系（Au@Pt + TMB）（图2A），证明了Au@Pt的POD活性高于氧化酶活性。在此基础上，为了确定Au@Pt催化体系中潜在的活性氧物种（ROS），分别以PBQ和IPA作为超氧阴离子（O₂·-）和羟基自由基（OH）的清除剂。图2B显示PBQ作为清除剂对Au@Pt的活性具有更大的抑制作用，表明O₂·-和¹O₂的产生是影响Au@Pt催化效果的关键因素。随后优化了反应体系中缓冲液的pH值（图2C），结果表明，与天然HRP酶相比，Au@Pt纳米酶在pH = 4~10的范围内均能保持较好的催化活性。此外，对Au@Pt模拟POD的活性进行稳态动力学分析，结果表明，其POD活性符合Michaelis-Menten动力学（图2D-E），与HRP和其他纳米酶相比，Au@Pt具有更强的底物亲和性与更强的催化活性。且随着Au@Pt的浓度增加，其催化能力增强（图2F）。    

图1. （A、B）Au的TEM图像。（C、D）Au@Pt的TEM图像。（E、F）Au和Au@Pt的粒度分布直方图。（G）HAADF-STEM图像和Au@Pt的EDS元素映射。

图2. （A）Au@Pt氧化酶活性和POD活性的比较。（B）活性氧物种（ROS）的确定。（C）Au@ Pt催化底物TMB的最佳pH确定。Au@Pt模拟POD的稳态动力学分析：速度随TMB浓度的变化曲线（D）和速度随H₂O₂浓度的变化曲线（E），其中K_m值越低，表明酶对底物的亲和力越高，V_max值越高，表明酶的催化活性越高。（F）不同浓度Au@Pt催化底物TMB的动力学曲线。    

2、抗体及半抗原的偶联与ELISA方法的建立

本研究采用物理吸附法制备Au@Pt-mAb探针；采用EDC/NHS法和混合酸酐法将吡虫啉半抗原与OVA偶联，随后采用棋盘法筛选抗体和OVA-半抗原的最佳比例（图3）。结果表明，EDC/NHS法具有较高的偶联率，节省了小分子抗原的用量和抗体的用量；通过混合酸酐法合成的OVA-半抗原的效力较低，可能是由于在OVA和半抗原的偶联产物中存在副产物，影响了OVA-半抗原的特异性和灵敏度。

为提高ELISA方法的分析性能，本研究不仅优化了包被原合成方法，还优化了包被原浓度、抗体浓度、封闭液BSA浓度、显色时间和荧光素种类等参数（图4、图5）。其中，本方法通过显色底物oxTMB淬灭荧光染料来建立荧光信号模式，将罗丹明B、罗丹明6G和FITC三种荧光染料进行比较，结果表明oxTMB可以有效淬灭罗丹明B和罗丹明6G染料的荧光，且对后者的荧光淬灭效果更明显（图6），因此选用罗丹明6G作为荧光染料构建荧光模式ELISA。

图3. （A）EDC/NHS法最佳抗体：OVA-半抗原= 1：0.1（mg/L）。（B）混合酸酐法最佳抗体：OVA-半抗原= 2：10（mg/L）。   

图4. （A）包被原浓度优化。（B）抗体浓度优化。

图5. （A）封闭液BSA浓度优化。（B）显色时间优化。

图6. Au@Pt、oxTMB、TMB对不同荧光试剂的淬灭效果。

3、比色/荧光模式的评价

在最优条件下，构建两种模式下的IMI标准曲线并进行评价（图7）。随着IMI浓度的增加，652 nm处的比色信号逐渐减弱，荧光信号逐渐增强。本方法在比色模式下对IMI的LOD为0.88μg/L，在荧光模式下的LOD为1.14μg/L，均低于常规ELISA（1.21μg/L）。且与其他研究相比，本研究构建的方法检测IMI的灵敏度也更高（表1）。    

图7. （A）比色模式下IMI标准曲线。（B）荧光模式下IMI标准曲线。         

表1. 已报道的IMI检测方法与本研究所建方法的比较。

4、样品添加回收试验

为进一步评价双模式ELISA检测方法在真实样品检测中的可行性，以卷心菜、黄瓜和西葫芦三种蔬菜作为加标样品（空白样品通过LC-MS/MS确认不存在IMI），以5、10和50 μg/L的浓度添加IMI并用甲醇提取，进行回收试验。测得的比色信号与IMI浓度成反比（图8A），而荧光信号与IMI浓度成正比（图8B）。    

三种蔬菜样品中IMI的添加回收率及RSD见表2。结果表明，该方法的比色和荧光模式在IMI定量分析中十分可靠，具有良好的准确度和精密度，可用于检测复杂蔬菜基质样品中的IMI。用两种模式下不同蔬菜基质中IMI的添加回收试验结果所建立的线性回归方程见图9，由结果可知，两种模式彼此印证了检测的准确性。

图8. 比色和荧光模式检测三种蔬菜基质中IMI（A）IMI浓度对数与抑制率的线性关系。（B）IMI浓度与荧光强度的线性关系。

表2. 蔬菜样品中IMI的添加回收率及RSD。

图9. 用两种模式下不同蔬菜基质中IMI的添加回收试验结果建立线性回归方程（x轴：比色模式测量：y轴：荧光模式测量）。

【小结】

本研究建立了基于Au@Pt的双模式ELISA方法用于检测蔬菜中的IMI残留。该方法制备的Au@Pt-mAb识别探针具有催化和识别的双重功能，其中Au@Pt作为信号元件催化TMB产生具有荧光淬灭能力的oxTMB，实现了对IMI残留的比色和荧光双模式分析。与传统ELISA相比，本方法提高了检测效率，降低了检测成本，具有良好的准确性和更高的灵敏度（比色模式LOD为0.88μg/L，荧光模式LOD为1.14μg/L；常规ELISA方法LOD为1.21μg/L），可满足IMI检测的应用需求，为IMI农药检测提供了一种灵敏、准确的技术。此外，Au@Pt双模式免疫传感器的建立可为其他小分子检测技术的研发提供可行方案。

【原文出处】