摘要：
除了其生物学功能外，蛋白质的稳定性是其适用性的主要决定因素。不幸的是，为了改善蛋白质的功能而改造蛋白质通常会导致蛋白质的不稳定。这种所谓的稳定性-功能性权衡可以用一个简单的事实来解释，即蛋白质的一种新功能的生成或现有蛋白质功能的改进需要插入突变，即偏离进化优化的野生型序列。事实上，功能获得性突变并不比其他随机突变更不稳定。稳定性和功能的权衡是蛋白质进化过程中普遍存在的现象，已经在完全不同类型的蛋白质(包括酶、抗体和工程结合支架)中观察到。在这篇综述中，我们讨论了三种已经成功克服蛋白质工程方法中这一无所不在障碍的策略:(i)使用高度稳定的亲本蛋白，(ii)在功能优化中最大限度地减少不稳定程度(通过库优化和/或稳定性和功能的共选择)，以及(iii)通过稳定性优化修复受损突变体。在蛋白质工程中实施这些策略将促进高效生成蛋白质变体，这些变体不仅具有功能性，而且稳定，因此更适合后续应用。
蛋白质稳定性的实际意义
蛋白质稳定性是蛋白质适用性的一个关键因素。在许多情况下，蛋白质作为功能分子是远远不够的。相反，对于广泛的应用，要求蛋白质的高稳定性。两个突出的例子包括工业中使用的酶，它们需要具有高度的耐热性，以允许工艺温度升高和治疗性蛋白质，它们需要在37°C下至少几天或几周内保持其在人血清中的固有折叠和功能。
作为一个具体的例子，Willuda等人证明了针对肿瘤相关抗原上皮糖蛋白-2的高亲和力单链抗体(scFv)在小鼠模型实体肿瘤中不能有效富集；只有通过将其互补决定区域(CDR)嫁接到高度稳定的4D5框架中，才能实现有效富集。这是一个典型的例子，一个蛋白质是有功能的(即，它与它的抗原结合，具有高亲和力)，但在应用中失败，因为不够稳定。
除了由最终应用决定的稳定性阈值外，蛋白质稳定性通常与表达水平相关。一些研究报告称，稳定结构折叠不好的蛋白质可使表达产量提高几倍，而稳定单链TCR克隆甚至可使其表达率提高100倍以上。由于实际应用需要合理的表达滴度，蛋白质稳定性和表达滴度之间的这种充分证明的相关性是寻找稳定的蛋白质变体的另一个重要原因。
稳定蛋白质的另一个好处是它们倾向于表现出更好的溶解性。例如，通过酵母表面展示对单链TCR克隆体进行稳定性优化，使其溶解度提高了40倍。与溶解度相关的另一个重要性质是蛋白质的聚集性。虽然在稳定折叠的蛋白质中聚集行为和稳定性不一定相关，但不稳定的蛋白质通常倾向于聚集，这可能是部分去折叠和疏水残基暴露的结果。Pechmann等人在一项关于蛋白质-蛋白质复合物结构的全面的计算研究中提出了对这一观察结果的另一种或替代解释，他们证明了蛋白质-蛋白质相互作用表面相对于其他蛋白质表面更具有聚集性。然而，这些“粘性”表面区域经常通过二硫键和盐桥来稳定它们的原始单体状态，从而防止了非特异性的自相互作用(即聚集)。因此，不稳定蛋白质聚集趋势的增加可能是由于部分去折叠导致隐藏的疏水侧链的暴露和/或粘性表面残基灵活性的增加。
描述蛋白质稳定性的参数
尽管即使是相对较短的多肽也可能有无数种构象，但蛋白质具有可靠折叠成其固有结构的非凡能力。然而，重要的是即使在室温下所有的天然蛋白质都处于与其天然状态和变性状态的平衡。这种天然态和变性态之间的平衡是由去折叠吉布斯自由能(ΔG)定义的，这是一个常用的描述蛋白质稳定性的参数。也就是说，更稳定的蛋白质含有更小比例的变性状态分子。
除了ΔG，热稳定性也是一种经常报道的稳定性测量方法。描述热稳定性最常用的参数是热变性中点(Tm)。另外，在一个逐渐增温过程中，50%的蛋白质发生不可逆变性的温度(T50)可以通过分析蛋白质活性(例如，酶活性或抗原结合)来确定。值得注意的是，Tm和T50并不相同，但通常表现出非常密切的相关性(图1D,F)。
最后，还可以用尿素或其他变性剂诱导的抗变性性来测量蛋白质的稳定性，例如，诱导50%变性所需的浓度(Cm)。重要的是，ΔG, Tm, T50和Cm描述了蛋白质稳定性的不同方面。然而，总的来说，这些参数之间有很好的相关性，特别是在比较同一蛋白质的不同突变体时，如图1所示。因此，为了简单起见，在这篇综述中，术语“蛋白质稳定性”将被用作描述天然蛋白质折叠的稳健性的通用术语，除非指明了特定的稳定性参数。
图1 不同稳定性参数之间的相关性。(A) 细胞色素P450 BM3变异的Cm和T50之间的相关性；(B) T4溶菌酶突变体ΔΔG和ΔTm的相关性；(C, F) 枯草芽孢杆菌脂肪酶突变体(C) Cm与T50、(F) T50与Tm的相关性；(D) IgG1-Fc变异的T50和Tm之间的相关性；(E)纳米体cAbBCII10的二硫化物变体的ΔG°和Tm之间的相关性。
稳定性和功能性的权衡
由于蛋白质的生化功能和折叠稳定性对其生物活性都有显著影响，因此这两个特征在进化过程中被广泛优化就不足为奇了。因此，大多数引入天然蛋白质或蛋白质结构域的随机突变会导致不稳定。在Tawfik及其同事的一项综合研究中，使用FoldX算法计算了21种不同球形单域蛋白中所有可能突变的稳定性效应(ΔΔG)。重要的是，作者还实验测量了1285个突变体，验证了他们的计算机预测结果。这项研究得出了几个重要发现:(i)蛋白质中的大多数突变是不稳定的，这并不奇怪，因为序列偏离了进化中的优化版本;(ii)突变ΔΔG效应的总体分布在不同蛋白质之间具有高度可比性;(iii)表面残基突变的不稳定性平均要比核心位置突变低得多。在一项实验研究中观察到类似的稳定性效应分布，其中测量了几乎所有G蛋白(Gβ1)单突变体的ΔΔG值。
由于大多数突变的不稳定效应，在蛋白质中引入新功能或对现有功能进行优化几乎不可避免地导致工程多肽的稳定性损失。也就是说，为获得功能而选择的大多数突变是不稳定的。这种现象通常被称为稳定性-功能性权衡。重要的是，Tawfik及其同事的另一项研究表明，赋予新功能的突变的稳定性效应(ΔΔG)的分布与相应蛋白质中所有可能的突变的分布非常相似这些数据表明，与获得新功能相关的不稳定效应主要是引入突变的必要性的结果，而不是因为这些突变特别不稳定。例外情况是酶中的许多关键催化残基，它们通常是高度不稳定的，例如，因为它们中的许多是极性或带电的残基，但位于疏水口袋中。
假设突变对稳定性的影响在很大程度上是独立的(即相加的)，人们可以期望平均每个突变都有同样的可能性使蛋白质失稳，从而使蛋白质失活。因此，可以预期蛋白质的适应度(即活性)随着插入突变的数量呈指数级下降。事实上，这种被称为“梯度稳健性”的关系已经在一些松散的、略微稳定的蛋白质(如高度突变的RNA病毒的蛋白质)中观察到。然而，对于稳定的蛋白质，蛋白质适合度与突变数之间的关系通常不同于梯度稳健性模型，因为这些蛋白质具有额外的稳定边界，可以在蛋白质适合度大幅下降之前耗尽。也就是说，尽管前两个突变确实会损害蛋白质的稳定性，但它们只会轻微地损害蛋白质的适应性。然而，一旦稳定性降低到一定阈值以下，蛋白质的适合度就会迅速下降。因此，这一模型被称为“阈值稳健性”或“负互加性”，后者表明突变对蛋白质适应度的负面影响大于加性(因为在某一时刻，稳定裕度被耗尽，负面影响变得更加明显)。
蛋白质稳定性是蛋白质工程中需要注意的一个生物物理参数，因为在新蛋白质功能生成时通常会观察到相当大的不稳定效应。图2A描述了蛋白质工程过程中稳定性-功能权衡的简单模型。在这个模型中，假设几个氨基酸位置同时随机突变，目的是产生一个新的结合表面。作为这种广泛诱变的结果，绝大多数产生的蛋白质变异是不稳定的。此外，这些大部分不稳定的变异中很少有显示所需的功能，即抗原结合(粉红点;图2A)。然而，由于相当大的不稳定效应，许多理论上可以产生具有适当亲和力的蛋白质变体的多肽不能折叠成它们的原始结构，从而妨碍了对其生化功能的检测。其他一些突变体表达为具有抗原结合活性的原始或部分折叠蛋白，但由于上述各种原因，它们对于预期的应用来说太不稳定了。因此，在该模型系统中，定义了两个稳定性阈值:(i)产生具有可检测功能的折叠多肽所需的阈值和(ii)由最终应用决定的更高的阈值(图2A)。
在图2A所示的模型中，具有所需抗原结合能力的蛋白质突变体(粉红色点)要么被错误折叠，要么被折叠成功能蛋白，如果它们不满足最终应用所需的稳定性阈值。由于这种情况在各种类型的蛋白质工程实验中经常被观察到，已经有了几种策略来克服这种稳定性和功能的权衡，这些策略将在以下部分进行讨论，并在图2B中简要总结。
图2 一个简单的稳定性-功能权衡模型和克服这一障碍的策略。(A) 简要描述随机突变的不稳定效应。假设几个氨基酸位置同时随机突变，目的是设计一个人工结合表面，会导致大多数突变体的不稳定。(B)为了克服这种稳定性和功能的权衡，主要有三种方法:(I)使用高度稳定的亲本蛋白，(II)最大限度地减少与插入突变相关的不稳定，(III)通过各种稳定策略挽救不稳定的蛋白质。
策略一：选择高度稳定的亲本蛋白
一种方法是在工程优化中使用高度稳定的亲本蛋白(图2B，策略I)。这种方法是基于观察到稳定蛋白具有额外的稳定边界，可以在其适应度受到严重影响之前耗尽，即如上所述的“阈值稳健性”。在一项具有里程碑意义的研究中，其标题是“蛋白质稳定性促进进化性”，Arnold及其同事证明了相对于略微稳定的对应物(T50 =47°C)，从耐热性细胞色素P450 BM3血红素结构域(T50 =62°C) 可以更有效地进化出功能改进的变体。此外，获得的突变体的热稳定性优于由不稳定的P450版本进化而来的突变体。这项研究表明，在蛋白质工程中使用高度稳定的蛋白质具有两个关键优势:(i)由于突变耐受性的增加而提高了进化性;(ii)更稳定的工程变体(图2B，策略i vs图2A)。重要的是，基础阈值稳健性模型的有效性，即在更稳定的蛋白质中增加对突变的耐受性，已在其他蛋白质的进一步研究中得到证实，因此不是P450血红素结构域的固有属性，而是蛋白质的一般特征。
考虑到稳定性决定的蛋白质进化性，使用高温稳定蛋白作为工程方法的起始支架是一个有吸引力的策略。例如，分别来自嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius和Sulfolobus solfataricus的小高热稳定蛋白(7 kDa)Sac7d和Sso7d已被广泛用于具有抗体样亲和力的迷你粘合剂。这两种蛋白质都非常稳定，Tm值分别为90°C (Sac7d38)和99°C (Sso7d39)(图3)。正如预期的那样，这些高温稳定蛋白对突变具有高度耐受性，能够高效生成高亲和力的结合剂，针对几乎任何目标分子，包括蛋白质、多肽和小分子。
一般来说，大多数用于结合剂工程的支架蛋白都是高度稳定的，因此相对耐受突变(图3)。然而，Sso7d(99°C)的Tm明显高于其他结合支架。相比之下，Fyn激酶的SH3结构域(fynomers的野生型结构域)的Tm为71°C,来自蛋白A的Z结构域(词素的野生型支架)的Tm为79°C,和人纤维连接蛋白的第10个III型结构域(FN3结构域，单体的野生型支架)的Tm为86°C。因此，尽管所有这些其他结合支架都是高度稳定的蛋白质，但Sso7d提供了相当高的稳定边界，在工程过程中可能会丢失，而不会对蛋白质适合度产生任何重大影响。此外，除了额外的稳定性所提供的改进的可进化性外，来自Sso7d的大多数粘合剂都是高度稳定的，Tm值通常在60到100°C之间，为大多数应用提供了足够的稳定性。有效用于蛋白质工程目的的稳定亲本支架的其他例子包括基于稳定框架区域的单链蛋白库以及设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)，这些蛋白是通过共识设计有目的地设计为稳定的。
本质超稳定支架蛋白的另一种使用方法是提高亲本蛋白的稳定性。特别是在特定的生化和/或生物活性需要选择相对不稳定的蛋白质作为起始支架的情况下，有可能在功能工程之前首先增加亲本分子的稳定性。提高蛋白质稳定性的策略包括合理设计和基于定向进化的方法，下文将进一步讨论。
图3 五种优良亲本粘结剂支架的热稳定性比较。描述了以下结构:Sac7d (PDB ID 1AZP52);Sso7d (PDB ID 1BNZ53);Fyn激酶的SH3结构域(PDB ID 3UA654);Z结构域来源于蛋白A (PDB ID 2SPZ55);FN3域(PDB ID 1FNF56)。
策略二:尽量减少不稳定程度
提高文库适合度。除了亲本蛋白的稳定性外，与工程相关的稳定性损失是另一个需要考虑的重要因素(图2B，策略II)。已经报道了几种策略，其总体目标是提高文库的适合度，即尽量减少插入随机突变引起的不稳定(图4)。
如上所述，几项关于突变稳定性影响的综合研究表明，表面残基比埋在蛋白质核心中的残基对突变的耐受性要高得多。因此，将诱变重点放在溶剂可及的残基上是非常可取的。虽然这可能不是(或可能只是部分)酶的一种选择，酶通常具有相对隐藏的活性位点，但这一基本规则是设计抗原结合支架库的一个很好的起点。在这种情况下，与抗原相互作用的功能要求和更高的突变耐受性都要求在溶剂可及位置发生突变。因此，高分辨率结构是文库设计的一个主要优势。除了确定溶剂可及性外，结构还允许观察侧链相互作用，这也可能是不突变特定残基的原因。
为了进一步提高文库的质量，蛋白质工程师还应该避免在进化高度保守的位置发生突变，因为众所周知，自然进化中的保守性与突变不耐受相关。因此，亲本蛋白的系统发育分析是库中随机选择氨基酸位置的宝贵资源。
另一种强大的方法是构建模型库，其中不同的位置或位置的组合随机突变，然后对产生的突变体进行高通量分析，例如，通过流式细胞术。例如，hackkel和同事们生成了一组酵母显示的FN3库，其中一个具有完全随机化的循环区域，以及几个与完全多样化设计相同的库，除了在某一特定位置具有野生型守恒(每个库在不同的循环位置显示野生型守恒)对所得到的模型文库进行高通量流式细胞术分析，得到了稳定性因子(由酵母表面的全长显示确定，这被证明与稳定性相关)，表明在这些环区域内的每个位置野生型保守的贡献。通过(i)这些模型库，(ii)对不同物种FN3结构域的系统发育分析，以及(iii)每个候选位置的溶剂可及表面积(SASA)的确定，可以在选定位置构建具有完全或部分野生型保护的下一代FN3文库。通过流式细胞仪分析，这种改进的库(称为第四代，G4)的表现明显优于对照FN3库。此外，为了直接比较其产生功能性抗原结合变体的能力，改进的G4库与两个相似的不同控制库合并，然后选择与七个不同的靶标结合。值得注意的是，对富集结合物的序列分析表明，21个突变体中有19个来自G4文库，这清楚地证明了基于模型文库的实验结果以及结构和系统发育分析的文库设计的优越性。
除了在选定的位置(如上述位置)具有野生型保护的模型库之外，其他模型库设计也已被证明为生成高质量的图书馆提供了信息。Hasenhindl等人在人IgG1-Fc.的CH3结构环区域的不同氨基酸链上完全随机化构建了一套酵母显示文库将酵母显示文库置于不同的孵育温度下，然后分析其与结构特异性配体的结合情况，从而确定不同文库库的总体热稳定性(T50)。这些实验表明，不同loop的突变耐受性存在显著差异。例如，EF loop中仅两个位置(R416和W417)的随机突变比五个相邻残基(418−422)的更大片段的完全突变导致略强的不稳定。R416和W417残基明显的突变不耐受可能是由R416和E388之间形成的盐桥和W417侧链定位在CH3结构域的疏水核心所导致的。
深度突变扫描是测定不同氨基酸位置突变耐受性的一种可供选择的实验方法。简单地说，这种方法是基于对随机突变文库的高通量选择，然后进行深度测序分析，并确定文库中每个突变的富集分数IgG1-Fc的深度突变扫描在单残基分辨率下获得了整个CH3结构域的稳定性。也就是说，每个氨基酸位置的突变耐受量可以在一次实验中确定。尽管实验方法存在差异，但该稳定性格局中的突变耐受与从CH3结构域的模型库中获得的突变耐受高度一致。
图4 减少不稳定和创建优质蛋白质库的策略。系统发育分析揭示了保守的位置，而模型库(这里描述的是PDB ID 1FNF56)可用于识别突变耐受区域。此外，深度突变扫描和结构分析(这里以PDB ID 1FNF为例)可以进一步提示单个氨基酸位置的突变耐受能力。
稳定性和功能的共选择。除了选择随机突变的最佳位置外，在定向进化过程中减少不稳定的另一种方法是稳定性和功能的共选择(图5)。在Tessier实验室的两项研究中，研究了酵母显示引导的人类单结构域(VH)抗体亲和成熟的进化机制。在最初的实验中，选择压力主要指向改善的亲和性，产生亲和成熟但强烈不稳定的VH结构域，因此代表了一个显著的稳定性-功能权衡的经典例子为了防止这种相当大的稳定性损失，作者进行了额外的定向进化实验，其中他们同时选择了亲和性和稳定性。这种改良的选择策略使亲和力成熟的变异得以富集，而这些变异只有轻微的不稳定。正如预期的那样，对稳定性和亲和性共选择过程中积累的突变的详细分析表明，几个增强亲和性的突变显示出不稳定的作用。有趣的是，两个稳定的突变部分地补偿了这种不稳定，不仅提高了稳定性，而且提高了总体亲和力，这两项研究很好地证明了提高功能和稳定性的共选择是可能的，并且蛋白质可以通过积累一组对蛋白质功能和/或稳定性有积极影响的突变来适应这种双重选择压力。
值得注意的是，这种现象不仅在实验室中被观察到，而且在自然进化中也被观察到。例如，在β内酰胺酶对新型抗生素的进化适应过程中，功能增强突变往往是不稳定的，因此需要共富集稳定突变来弥补稳定性损失。
B细胞中抗体的亲和成熟是自然进化过程的另一个例子，在这个过程中，已经观察到功能和稳定性的共选择。在Shehata及其同事的一项高通量研究中，他们分析了来自不同人类B细胞区室的数百种抗体在体内亲和成熟过程中获得的体细胞突变的含量以及它们的热稳定性。66个来自naïve B细胞的单克隆抗体的热稳定性明显高于来自亲和成熟的B细胞群的单克隆抗体。作者还提供了额外的实验证据，证明亲和成熟过程中体细胞突变的引入确实是导致不稳定的原因，因此代表了稳定性-功能权衡的一个完美例子。重要的是，虽然前10个体细胞突变导致热稳定性在统计上显著下降，但在包含11−20或甚至超过20个突变的单克隆抗体中没有进一步的不稳定。这有力地表明，存在一个稳定阈值去维持在体内生发中心的竞争力，因此，一旦达到这个稳定阈值，就需要对稳定性和功能进行重新选择。
同样，在SARS-CoV-2大流行期间，人类目前正在实时体验蛋白质的自然进化。随着时间的推移出现了各种突变，其中一些在刺突蛋白(S)中的D614G突变已被证明持续存在，表明比其他变体具有生存优势。的确，在几个细胞培养实验中显示了D614G变体的传染性增加，并且似乎至少部分是由刺突蛋白构象向受体结合和融合能力状态的转变所介导的。有趣的是，几个研究小组通过计算预测了D614G对蛋白结构的稳定作用，这可能进一步带来选择优势。此外，Teng等人计算分析了所有可能的S蛋白突变的稳定性效应(ΔΔG)。有趣的是，他们将这组理论上可能的突变与迄今为止报道的237个病毒错义变异进行了比较，发现(i)稳定突变的明显过度代表，以及(ii)自然发生的病毒变异队列中强烈不稳定突变的明显耗尽。同样，在另一项研究中，对循环的SARS-CoV-2毒株中富集的突变进行的计算机分析显示，各种SARS-CoV-2蛋白的稳定突变和不稳定突变之间存在显著的平衡。总之，这些研究强烈表明，存在着保持(甚至改善)SARS-CoV-2蛋白质稳定性的选择压力，从而代表了蛋白质稳定性和功能的增选的一个解释性现实例子。
图5 功能和稳定性的选择。仅对功能进行选择可能产生高亲和力(或酶活性)但不稳定的突变体。因此，进一步的参数，如热稳定性、表达和蛋白酶抗性，可用于产生功能和稳定的变体。
策略三：修复受损突变体
如果功能改进导致严重的不稳定效应，从而阻碍了工程蛋白的应用，则可以通过稳定来修复突变体(图2B，策略III)。当然，保持足够的稳定性是能够根据其生化功能从文库中富集先导候选蛋白的先决条件。因此，修复“受损”变异只应该被认为是无意中强烈失稳突变体的一种选择，而不应该是标准蛋白质工程管道的一部分。相反，上面描述的另外两种策略，即使用高度稳定的亲本蛋白和/或最小化功能工程过程中的稳定性损失，应该是首选的，因为这些方法不仅可以产生更稳定的工程变体，而且还可以增加原始文库的功能多样性，从而增加蛋白质的进化性。
然而，在某些情况下，修复有希望的低稳定性先导候选者是值得的(图6)。例如，经过工程改造的her2结合Fc抗原结合(Fcab)克隆H10-03-6在体外和体内都对her2阳性癌细胞株显示出有希望的生物活性，，但它的稳定性相对较低，而且倾向于聚集。酵母展示中，在结合到抗原和结构特异性配体后，增加一个热孵育步骤产生了一个变异，略有适应抗原结合区。该突变体表现出较高的热稳定性，较强的抗聚集性和较高的溶解度，尽管亲和性略有损失(约5倍)。在其他方法中，相同的Fcab先导候选H10-03-6通过在其CH3结构域中引入非原生二硫键来稳定，表明可以应用不同的策略来拯救不稳定的工程突变体。在合理设计二硫键后，其他各种蛋白质的稳定性也有所增加，包括纳米抗体、假单胞菌外毒素A的结构域III、和一种热溶素样蛋白酶，验证了这一稳定策略的普遍适用性。
将抗体CDR移植到稳定的框架上是另一种特别有吸引力的稳定策略，如果主要候选是杂交瘤衍生的非人抗体，因为在这些情况下，稳定可能与人源化过程结合(如果选择人受体框架)。McConnell等人通过结合多种稳定策略，包括稳定人类框架区域的选择、共识设计、引入额外的二硫键和计算设计，生成了高度稳定的抗体框架。值得注意的是，将来自10种不同的人或鼠抗体的CDR区域植入到这个优化的抗体框架上，可以稳定10个单克隆抗体中的8个。此外，除了一种情况外，所有情况下的亲和度都保持在亲本抗体的3倍以内，这是值得注意的，因为CDR嫁接通常伴随着显著的亲和损失。因此，除了抗体人源化外，CDR接枝一般可用于提高抗体的热稳定性或化学稳定性。
CDR移植稳定蛋白支架也已成功地应用于scFv。此外，即使是工程FN3结构域的抗原结合区也已成功地嫁接到通过共识设计获得的稳定FN3支架上，表明可以普遍的通过环嫁接实现稳定性的增加，而不仅仅局限于抗体CDR区。
图6 修复受损蛋白质突变体的策略。蛋白质稳定策略的例子包括引入额外的二硫键，CDR移植到稳定的框架区域(这里稳定的框架4D5 (PBD ID 1FVC78)，酵母展示选择和计算设计(PDB ID 1AZP52)。
结论
总的来说，蛋白质稳定性在实验室和自然界的蛋白质进化过程中都起着至关重要的作用。从一开始就实施旨在提高蛋白质工程稳定性的方法，不仅可以产生具有优越特征的蛋白质突变体，还可以减少后续修复不稳定蛋白质的时间和工作。因此，应该使用上述讨论的一系列方法来避免经常观察到的稳定性-功能权衡，这些方法可以结合起来，不仅可以实现功能，而且还可以实现高度稳定和易于应用的蛋白质。
指导教师：王战辉
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