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目前大多数疫苗被认为是通过诱导保护性抗体反应来预防疾病的。
为了通过疫苗接种引起保护性体液免疫，B细胞必须被激活，进入生发中心（germinal centers），经历抗原受体的亲和成熟，然后分化为分泌抗体的长寿浆细胞或在再次暴露于病原体时参与回忆反应的记忆B细胞。氢氧化铝(明矾)是疫苗中最普遍的佐剂也是已知最古老的佐剂之一。明矾的功能很复杂，可能依赖于注射部位炎症细胞死亡的诱导、先天免疫敏感途径的激活以及注射部位和/或引流淋巴结(LNs)趋化因子和细胞因子的产生。虽然在许多疫苗中有效，但在临床和临床前研究中，明矾引发的免疫反应往往比其他佐剂弱。尽管有这些限制，但对疫苗安全性的严格要求使新佐剂的成功开发成为一项重大挑战，明矾仍然是所有佐剂的重要金标准。
本研究旨在通过评价明矾是否可以通过抗原与明矾的相互作用来增强其功能，从而了解这种经典佐剂的免疫作用机制。虽然明矾最常用于将抗原吸附到明矾颗粒上供给药，但众所周知，在血清或间质液存在的情况下，许多抗原会迅速从明矾中解吸。此外，体内抗原清除率通常不受预吸附到铝的影响。
因此，我们设计了一种与明矾紧密结合的免疫原，通过位点特异性引入多价磷酸丝氨酸(pSer)肽-聚合物亲和标签，该标签与明矾表面进行配体交换反应，以定向方式将免疫原固定在明矾颗粒上。然后，我们研究了这种修饰如何改变这些免疫原在体内的命运和由此产生的免疫反应。
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特异位点引入pSer亲和标签可促进免疫原与明矾的稳定结合
作者通过磷酸基团和明矾颗粒表面羟基之间的配体交换来介导与明矾的结合。通过固相合成制备了由1-12个连续pSer、短聚乙二醇间隔物和N端马来酰亚胺官能团组成的肽（图1-1）。
首先将带有一个、两个或四个pSer基团的连接子偶联到酵母细胞色素c上，该细胞色素c具有暴露于半胱氨酸的游离溶剂。随着标签中丝氨酸残基数量的增加，pSer修饰的细胞色素c与明矾的结合稳步增加。为了评估pSer价态在实现与明矾稳定结合中的作用，我们用2-20个接头修饰了240 kDa荧光蛋白藻红蛋白（PE），其中每个接头含有一个或四个pSer残基。将pSer1-或pSer4-修饰的PE吸附到明矾上，然后在含有10%血清的缓冲液中孵育，通过荧光光谱法测量两步过程后与明矾结合的蛋白质。
如图1-2c所示，未经修饰的PE在明矾上几乎没有保留，但pSer标签促进了大部分蛋白质在明矾表面粘附>24小时。每种蛋白质只需要2-4个pSer4连接子就可以达到与10-20个具有单个pSer残基的连接子相同的结合水平。因此，即使对于非常大的蛋白质，用少量多价pSer标签进行修饰也能在血清存在的情况下促进与明矾的稳定结合。
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图1-1 用于位点特异性抗原修饰的聚乙二醇(PEG)亲和标签
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图1-2 磷酸丝氨酸介导蛋白质与明矾的结合并影响免疫反应
明矾在注射部位保留数周，但用明矾清除抗原通常要快得多为了确定pSer介导的抗原与明矾的结合如何影响体内抗原的可用性，BALB/c小鼠注射了AlexaFluor647（AF647）偶联的eOD或与明矾混合的pSer4-eOD，并通过全动物荧光成像追踪注射部位的荧光。未经修饰的eOD在3天内从注射部位清除，而pSer4 eOD持续超过3周（图2c，d）。作为额外的对照，我们注射了与磷酸铝混合的pSer4-eOD，这是一种明矾的替代临床制剂，与pSer标签进行配体交换的位点要少得多。在这种情况下，pSer4-eOD以与eOD相同的速率清除（图2c，d）。当改变pSer接头价态时，我们观察到四个或更多pSer残基的最大抗原持久性（图2e）。注射后8天注射部位的组织学显示pSer8eOD与明矾共定位，而未修饰的eOD无法检测到（图2f，g）。这些结果表明，pSer抗原在体内的清除速度比吸附在明矾上的未修饰抗原慢得多。
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图2 pser亲和标签使免疫原与氢氧化铝佐剂的结合可控
pser免疫原:明矾免疫增强体液免疫反应的多个方面
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含有4个以上丝氨酸的对照亲和标签不溶于水，因此我们选择将pSern-eOD蛋白与Ser4-eOD蛋白进行比较。Ser4-eOD:明矾或pSer-eOD:明矾免疫BALB/c小鼠，随着亲和标签中磷酸丝氨酸数量的增加，血清免疫球蛋白IgG滴度明显升高;与Ser4-eOD抗原相比，pSer8-eOD诱导的血清IgG滴度高48倍，持续6周以上(图3a,b)。无论疫苗是通过皮下还是肌肉注射途径接种，pSer-抗原:明矾免疫都是有效的(图3c)，我们没有检测到可测量的抗体对pSer连接体本身的反应(图1-2f)。此外，单次pser-抗原:明矾免疫3个月后，ELISPOT对骨髓浆细胞的分析显示，与对照Ser4-eOD相比，pSer4-eOD或pSer8-eOD免疫诱导的抗原特异性浆细胞增加了16倍(图2)。与血清修饰的eOD相比，pser修饰的eOD免疫使生发中心B细胞总数增加了1.5倍(图3e,f和图1-2g)。引人注目的是，在pser抗原免疫应答中，与eod结合的GC B细胞的百分比从2.8%急剧增加到33%(图3g,h和图1-2h)。总之，这些结果表明pser免疫原:明矾免疫促进体液免疫反应的定性和定量改善。
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图3 明矾结合pSer抗原在体内引起增强的体液反应
| 抗原特异性B细胞吞噬pser-抗原:明矾纳米颗粒在体外表现出增强的活化 |
明矾不是一个整体固体，而是由氢氧化铝纳米晶体的纤维聚集体组成的。在免疫原和明矾颗粒紧密结合的情况下，我们设想抗原随着时间的推移递送到LNs，可以通过在注射部位从明矾表面缓慢释放游离抗原来介导，或者抗原可以被运输到仍然与明矾纳米晶体结合的LNs上。为了评估B细胞遇到与明矾颗粒结合的抗原的潜在影响，我们测量了人类Ramos B细胞的活化，用pSer-eOD:明矾偶联物与eOD:明矾体外培养表达eOD特异性种系推断的VRC01抗受体20。正如之前报道的那样，游离单体eOD引发了接近基线的钙信号反应，与明矾混合的Ser4eOD也是如此(图4b)。相比之下，受pSer- eod:明矾刺激的B细胞显示出随着pSer价的增加而增加的活化(图4b)。与明矾和Ser4-eOD结合的明矾颗粒孵育的B细胞很少或没有摄取eOD，而与pSer8-eOD:明矾孵育的B细胞将明矾颗粒与eOD一起内化(图4 c, d)。通过透射电子显微镜(TEM)对这些细胞的高分辨率可视化显示，当pSer8-eOD与明矾结合时，纳米级明矾聚集体被B细胞内化(图5a, B)。这些结果表明，当抗原通过pSer键与明矾结合时，抗原可以表现为被B细胞内化的多价颗粒疫苗。
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图4 抗原特异性B细胞在体内有效地吸收与明矾颗粒结合的pser抗原![]()
图5 抗原特异性B细胞内化与明矾颗粒结合的pser抗原
在明矾上特异性固定HIV三聚体免疫原可以实现表位掩蔽 |
通过引入pSer连接子，将HIV Env三聚体MD39固定在明矾佐剂颗粒上，从而定向调控B细胞对抗原的响应。实验发现，与未修饰的MD39相比，pSer修饰的MD39在铝佐剂上的保留时间更长，且能诱导更强的IgG抗体反应。进一步结合皂苷类佐剂后，抗体反应得到进一步增强。更重要的是，通过pSer连接子定向固定MD39，限制了Env三聚体底部的免疫原性区域，促使B细胞更多地针对保护性表位（如gp120和gp41-gp120界面）产生抗体，从而显著提高了中和抗体的产生。这一策略为复杂抗原的疫苗设计提供了新的思路，即通过定向固定抗原来改变B细胞的特异性，进而增强疫苗的保护效果。
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图6 pser-抗原:明矾免疫增强HIV Env三聚体免疫原的体液应答
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佐剂是亚单位疫苗效力的核心。氢氧化铝(明矾)是最常用的疫苗佐剂，但其佐剂性往往较弱，引发抗体反应的机制尚不清楚。本文证明了用重复磷pSer残基组成的短肽对免疫原进行位点特异性修饰，增强了与明矾的结合，延长了免疫原的生物利用度。与传统的铝吸附免疫原相比，在明矾中配制的pser修饰免疫原可显著提高生发中心、抗体、中和抗体、记忆和长寿命的浆细胞反应。从机制上讲，pser-免疫原:明矾复合物形成纳米颗粒，通过多价和定向抗原展示运输到淋巴结并触发B细胞活化。B细胞对抗原修饰明矾颗粒的直接摄取上调了抗原加工和递呈途径，进一步增强了B细胞的活化。这些数据为明矾的作用机制提供了见解，可以显著提高使用临床佐剂的亚单位疫苗的体液免疫。
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Moyer TJ, Kato Y, Abraham W, Chang JYH, Kulp DW, Watson N, Turner HL, Menis S, Abbott RK, Bhiman JN, Melo MB, Simon HA, Herrera-De la Mata S, Liang S, Seumois G, Agarwal Y, Li N, Burton DR, Ward AB, Schief WR, Crotty S, Irvine DJ. Engineered immunogen binding to alum adjuvant enhances humoral immunity. Nat Med. 2020 Mar;26(3):430-440. doi: 10.1038/s41591-020-0753-3. Epub 2020 Feb 17. Erratum in: Nat Med. 2020 May;26(5):804. doi: 10.1038/s41591-020-0861-0. PMID: 32066977; PMCID: PMC7069805.
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41591-020-0753-3
指导老师：王战辉
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