单克隆抗体(mAbs)是免疫分析应用的重要工具，可用于监测环境污染物、食品中的农药以及霉菌毒素。作为半抗原的小分子化合物，通常与载体蛋白偶联，才会触发免疫反应。传统的杂交瘤技术，将产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞，用ELISA对细胞上清进行检测，对产生靶标特异性抗体的杂交瘤克隆进行鉴定和分离，并通过有限稀释法对杂交瘤细胞进行多次克隆，存在融合率低耗费时间等问题。
有研究表明，分泌抗体的杂交瘤细胞表面携带抗体，可以用抗免疫球蛋白抗体或偶联荧光染料的抗原进行染色。因此，本研究利用过氧化物酶标记的半抗原与荧光标记的抗过氧化物酶的抗体偶联物检测抗体的特异性，用荧光标记的抗鼠IgG的抗体鉴定抗体的分泌。随后，利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)验证染色的特异性，利用荧光激活细胞分选技术(FACS)通过融合混合物中半抗原特异性的单个杂交瘤细胞分选于多孔板中进行培养。最后通过直接ELISA检测方法，用半抗原−过氧化物酶对细胞上清进行检测。作者用雌激素酮（E1）和卡马西平（CBZ）为半抗原，建立了一种在单细胞水平上检测和分离分泌mAbs的抗原特异性杂交瘤细胞的方法，具有应用简单、省时省力等优点，为其他半抗原特异性抗体制备提供参考。
基于已制备的E1杂交瘤细胞，作者制定了一种使用荧光素标记的E1(E1−Flu)作为模型半抗原的细胞染色方案，通过FACS和CLSM鉴定，检测不到活细胞的染色信号。随后作者调整染色方案，将半抗原E1与HRP偶联制备E1-HRP复合物。E1特异性杂交瘤活细胞(E1＋)和E1非特异性杂交瘤活细胞（E1-）分别与E1-HRP孵育，然后用荧光团标记的抗过氧化物酶多抗(Anti−HRP−Alexa Fluor488)进行染色，经FACS和CLSM鉴定，抗原特异性标记成功（图1）。
图1.E1−HRP复合物标记活的杂交瘤细胞。(A)用E1−HRP、抗HRP−Alexa Fluor488(抗原特异性)和抗IgG−Alexa Fluor647(分泌IgG)标记杂交瘤细胞示意图。(B)流氏分析E1特异性杂交瘤克隆(E1−Hc7，绿色峰)和E1阴性杂交瘤克隆(E1−AA3，灰色峰)。仅与抗HRP−Alexa Fluor488孵育的E1特异性单克隆细胞做阳性对照(黑色虚峰)。(C)细胞表面表达IgG的活杂交瘤细胞的CLSM。特异性杂交瘤 (右图)和非特异性杂交瘤细胞(左图)。
2.从融合混合物中筛选单细胞并制备单抗
图2.单细胞分选技术在CBZ特异性单克隆抗体制备中的应用。(A)杂交瘤融合混合物的单细胞分选。CBZ+/IgG+双阳性细胞(绿色门)和CBZ−/IgG+细胞(灰色门) 分选于96孔板，37°C培养1周。(B)对存活的单克隆上清液进行直接酶联免疫吸附试验(ELISA)。91 个CBZ+克隆(绿色柱)and 162个CBZ−克隆(灰色柱)。
杂交瘤细胞可能会因为染色体丢失或表观遗传学改变而失去其特异性，甚至停止产生抗体，若单克隆的特异性或抗体分泌能力丧失，可通过流式细胞仪分析可见。作者用FACS对6个单克隆进行再分析，以检测它们与CBZ-HRP的结合特异性。结果显示，与CBZ—单克隆CBZ-2E11相反，所有CBZ特异的杂交瘤单克隆均与CBZ−HRP偶联物结合。这一结果验证上述ELISA结果，即6个单克隆细胞株均可产生CBZ+ mAbs（图3）。
图3.流式细胞术对CBZ-杂交瘤分选克隆的再分析。非特异性克隆CBZ-2E11 为阴性对照 (CBZ-2E11，黑色峰)。
图4.CBZ−HRP和CBZ对阳性克隆CBZ-2D8的竞争性结合。(A)流式细胞术分析竞争作用。(B) 显微镜观察CBZ−HRP与单克隆CBZ-2D8的结合。
Martin, Dippong, Peter, et al. Hapten-Specific Single-Cell Selection of Hybridoma Clones by Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Generation of Monoclonal Antibodies[J]. Anal. Chem. 2017，89：4007-4012.
