摘要：海葵毒素（PLTX）是地中海地区特有的烈性海洋毒素。本研究用鼠单抗作为捕获抗体，兔多抗作为检测抗体，开发了一种检测海产品中海葵毒素的间接夹心ELISA方法，检测限（LOD）为1.1 ng/mL，定量限（LOQ）为2.2 ng/mL；在贻贝提取物、微藻和海水中的LOQ分别为11.0、9.6和2.4 ng/mL，低于液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）且具有良好的准确性和精密度。
PLTX（Mw=2680 Da，图1）是甲藻和蓝藻产生的一种聚醚类生物毒素，可与钠钾泵互作而产生极强的毒性作用，食用含有PLTX的海产品可引起虚弱、呼吸紊乱、神经肌肉和心脏损伤等中毒症状。有研究曾在地中海沿岸的贝类、海胆、章鱼等海洋生物中检出PLTX。为了防止人类因食用受污染的海产品而中毒，应对PLTX进行检测。
PLTX常用的检测方法包括小鼠生物测定法、细胞毒性测定法、LC-MS/MS、表面等离子共振法（SPR）、以及基于钠钾泵的荧光偏振分析等。这些方法囿于灵敏度、准确性、检测速度、成本、动物福利、需要专用仪器等因素，实际使用受限。而免疫分析具有检测速度快、通量高、廉价易用等特点，或许能成为检测PLTX的优良方法。
目前已有关于PLTX单抗（mAb）制备与ic-ELISA、RIA（放射免疫分析）方法建立的报道，然而这些方法并未商业化亦未在真实的海鲜样品中进行测试。对此，本研究用鼠单抗作为捕获抗体（cAb），兔多抗作为检测抗体（dAb），开发了一种检测海产品中PLTX的间接夹心ELISA方法。该方法能以相似的方式检测PLTX和42-OH-PLTX（类似物），且LOD与LOQ低于欧洲食品安全局的要求，能满足PLTX的实际检测需求。
图1：PLTX及其类似物的结构
【研究内容】
一、抗PLTX单抗亲和力测定
本研究使用的mAb购自美国陆军传染病医学研究所。用SPR评估了mAb对PLTX及42-OH-PLTX的亲和力。分别用活泼酯法（PLTX末端有氨基）以及生物素-链霉亲和素法将PLTX固定于SPR芯片上。mAb在这两种固定方式下均能以高亲和力结合PLTX，解离常数(KD)约为2 × 10-10 M。随后将mAb固定于SPR芯片上，进一步评估其对PLTX及类似物42-OH-PLTX的结合能力。结果表明mAb与PLTX的KD可达nM水平，而对42-OH-PLTX的亲和力较弱，为μM水平（表1），证明这株mAb对PLTX高度特异。
表1:SPR测得的动力学参数
二、标准曲线的建立
将上述鼠单抗作为捕获抗体，用PLTX-BSA作为免疫原制备的兔多抗作为检测抗体建立间接夹心ELISA方法并绘制标准曲线（图2A）。曲线的线性范围为1.25−80 ng/mL；EC50=7.6 ± 1.1 ng/mL；LOD=1.1 ng/mL；LOQ=2.2 ng/mL；曲线的相关系数（r²）为0.9933，表明拟合效果良好。
评估了方法的试验内重复性（n=10）与6个月内的试验间重复性（n=10），二者均表现出非常好的相关性：试验内与试验间r2分别为0.9933和0.9807（图2B），RSDr分别为6%和9%。方法的重复性良好。
图2：夹心ELISA的标准曲线（A）与试验内重复性（B）
三、交叉反应性测定
评估了该方法对PLTX类似物的交叉反应性（CR）：发现在PLTX的线性范围（1.25−80 ng/mL）内该方法对生物素化PLTX的反应性与PLTX相似，而对42-OH-PLTX识别率略低（图3）。随后测试了该方法与其他海洋毒素（冈田酸、雪卡毒素、软骨藻酸、短裸甲藻毒素-3和石房蛤毒素）的CR：在上述毒素浓度高至100 μg/mL时仍未观察到显著的交叉反应，说明方法的特异性良好。
图3：方法对PLTX及其类似物的交叉反应
四、基质效应
首先将不含毒素的贻贝、微藻和海水提取物进行1:1、1:10和1:100稀释后检测有无阳性信号，发现上述稀释度下OD450均无显著增加，可用于后续试验。然后分别向上述稀释度的提取物加入1.25-80 ng/mL的PLTX，比较有无基质条件下的检测结果。结果表明，对于所有基质1:10的稀释度不会干扰检测：稀释10倍的贻贝、微藻和海水提取物的PLTX检测结果与无基质PLTX检测结果高度相关。具体而言：该方法在贻贝、微藻和海水提取物中的LOQ分别为11.0、9.6和2.4 ng/mL。R2分别为0.9663、0.9878和0.9719，Bias分别为1.5%、5.0%和8.0%，表明该方法在不同基质中的PLTX检测结果具有较高的准确性和一致性。
五、添加回收
向空白贻贝、藻类和海水样品中分别加入不同浓度的PLTX，经提取稀释后进行检测。该方法在贻贝、藻类和海水样品中的添加回收率分别为95.7-92.8% （CV=1-2.6%）、95.6-105.5%（CV=0.9-12.3%）、57.3-85.3%（CV=4.7-29.2%）（表2）说明该方法在贻贝和藻类基质中具有较高的回收率和一致性，而在海水基质中的回收率较低，存在较大变异。
表2:不同基质的添加回收结果
【小结】
本研究建立了一种灵敏、特异、准确且精密的PLTX间接夹心ELISA方法。该方法操作简便，不需要昂贵的设备或专业人员，适合大批量样本的快速检测，可以用于PLTX监测项目甚至由海产品生产者进行自检。
【原文出处】
Boscolo, S. et al. Sandwich ELISA Assay for the Quantitation of Palytoxin and Its Analogs in Natural Samples. Environ. Sci. Technol. 47, 2034–2042 (2013).
DOI:10.1021/es304222t
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/es304222t
指导教师：王战辉
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