摘要：利奈唑胺（LNZ）是一种用于治疗革兰氏阳性菌感染的广谱抗生素。本文合成了4种不同间隔臂长度的LNZ半抗原，制备出3种抗体，建立了符合临床检测需求的直接竞争ELISA检测方法，IC50为11.5-28.3 ng/mL，检测限为0.5-1.6 ng/mL，回收率为82.1-99.6%，变异系数为3.1-12.1%，线性范围1.4-260 ng/mL。
【引语】
利奈唑胺（LNZ）是一种对革兰氏阳性菌具有广谱活性的恶唑烷酮类抗生素，通常用于治疗皮肤和软组织感染。在治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素肠球菌（VRE）引起的医院感染尤为关键。研究表明，LNZ在达到最低抑菌浓度（MIC）≥85%或药时曲线下面积（AUC）/MIC >80的时候能发挥最大疗效，但在不同患者群体内的药代动力学差异较为显著，因此，准确测定患者生物体液中LNZ含量成为临床治疗的关键。
虽然高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）和超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）可以准确测定LNZ，但这些方法相对复杂，成本高，并且不能在医院中用于常规监测，而免疫分析方法由于测定方便、快速，成为临床诊断监测的可行方案。
基于免疫分析方法，本文首次合成了4种不同间隔臂长度的LNZ半抗原，并与葡萄糖氧化酶（GOD）或破伤风类毒素（TTD）以不同投料比进行偶联，分别制备免疫原和包被原，通过免疫兔制备出3种抗体，建立了可用于临床检测的直接竞争ELISA（dc-ELISA）方法。
【内容介绍】
1、半抗原的合成及偶联物的制备
本研究将LNZ去乙酰化作为Hapten 1；在此基础上，Hapten 1与丁二酸酐反应得到N-(3-羧基(1-氧丙基))N-去乙酰基利奈唑胺Hapten 2，Hapten 1与3-叠氮丙酸反应生成N-(3-叠氮(1-氧丙基))N-去乙酰基利奈唑胺Hapten 3，Hapten 1与5-叠氮戊酸反应得到N-(5-叠氮(1-氧丙基))N-去乙酰基利奈唑胺Hapten 4（图1），并通过结构设计估算出4种半抗原的间隔臂长度，分别为0、6.2 Å、9.4 Å和11.8 Å。
Hapten 1和2通过活泼酯法与GOD偶联， Hapten 3和4通过铜催化叠氮化物炔烃环加成反应与TTD偶联（图2）。Hapten 1与GOD以50:1和200:1两种投料比进行偶联，Hapten 2与GOD以10:1和100:1两种投料比进行偶联；Hapten 3和4与TTD偶联投料比均为50:1，共获得6种偶联物Hapten 1-GOD(50:1)、Hapten1-GOD(200:1)、Hapten 2-GOD(10:1)、Hapten 2-GOD(100:1)和Hapten 3-TTD(50:1)、Hapten 4-TTD(50:1)。紫外光谱（图3）证实了半抗原与载体蛋白偶联成功。
图1 LNZ及其类似物STZ结构及Hapten 1、Hapten 2、Hapten 3和Hapten 4的合成
图2 半抗原偶联载体蛋白方案
图3 半抗原、蛋白载体和偶联物紫外光谱
2、抗体制备及HRP标记
本研究用Hapten 1-GOD(200:1)、Hapten 2-GOD(100:1)和Hapten 3-TTD(50:1)作为免疫原分别免疫兔，制备出3种抗体anti-H1、anti-H2和anti-H3。在ELISA实验中，为获得可视化检测以及放大信号，通常会用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体或抗原，HRP能催化底物（如TMB）生成有色产物，放大结合信号，提高检测灵敏度。因此，对制备出的3种抗体通过高碘酸钠氧化法标记上HRP，同样的，偶联抗原Hapten 1-GOD(50:1)和Hapten 2-GOD(10:1)也被标记上HRP，以便开发抗体包被的检测方法。
3、间接/直接竞争性酶联免疫吸附试验
本研究首先用ic-ELISA对制备抗体进行性能检测，结果显示3种不同半抗原制备出的抗血清都能很好的识别LNZ（表1），3种抗体都能与异源抗原产生强烈的相互作用（表2），并显示出较高的灵敏度。
据此，建立dc-ELISA方法，作者采用了抗原包被和抗体包被两种模式。在抗原包被模式中，anti-H1、anti-H2、anti-H3所对应的包被原为Hapten 4-TTD(50:1)、Hapten 4-TTD(50:1)、Hapten 1-GOD(50:1)，检测方法的灵敏度（IC50）分别为16.9、28.3、11.5 ng/mL，线性范围分别为2.0-160、4.0-260、1.4-120 ng/mL（表3A）。在抗体包被模式中，如表3B所示，3种抗体分别包被，用标记了HRP的偶联抗原进行检测，IC50为0.48-0.75 ng/mL，线性范围0.16-3.2 ng/mL；但anti-H2与Hapten 1-GOD(50:1)-HRP、Hapten 2-GOD(10:1)-HRP无法联合使用，这可能是因为HRP标记使得结合活性丧失。两种模式分析比较，抗体包被模式具有更高灵敏度和更窄的线性范围，但较窄的线性范围对于临床测定LNZ浓度是极其有限的。LNZ在人体内Ctrough（谷浓度）为2-7 mg/L，Cmax（药峰浓度）可达20 mg/L，抗体包被模式的窄线性范围不适合在较高浓度下进行定量测定。对此，研究人员舍弃了更灵敏的抗体包被模式，选择具有较宽线性范围的抗原包被模式进行下一步的优化。
特异性实验表明，临床常与LNZ共用的抗生素如碳青霉烯类（亚胺培南、多利培南和艾他培南）、肽类抗生素（万古霉素、替可普宁和达托霉素）和氨基糖苷类（庆大霉素、卡那霉素和阿米卡星）在10 mg/L时均无交叉反应。STZ（Sutezolid，利奈唑胺类似物）在抗原包被的dc-ELISA中分别出现12%、27%和8%的交叉反应。4种半抗原具有相同的抗原决定簇，但间隔臂长度不同，因此被抗体识别的程度有所不同。零间隔臂的Hapten 1仅引发了针对抗原决定簇的免疫反应，因此anti-H1对4种半抗原的交叉反应率基本相同（82.1-121%）；Hapten 2和3由于间隔臂的影响，以及Hapten 1中未取代的氨基会对识别产生阻碍，因此anti-H2和anti-H3对Hapten 1的交叉反应率下降至21-22%；而带有酰胺基团的LNZ、Hapten 2和Hapten 4能被抗体更好地识别，交叉反应率保持在100-306%的水平（表4）。
表1 免疫接种后抗血清灵敏度检测
表2 3种抗体灵敏度检测
表3 （A） 抗原包被性能评价；（B）抗体包被性能评价
表4 交叉反应率检测
4、样品预处理和回收率测定
选择适合的稀释液能够有效富集样品或消除潜在干扰物质，从而可提高测量的准确性。本研究对血清样品预处理稀释液进行了优化，包括PBST、 TCA、MeOH和CAN。空白血清样品加标测试，用建立的dc-ELISA测定，发现使用TCA预处理的回收率最高，达到了82.1-99.6%，变异系数为3.1-12.1%（表5）。
表5 样品预处理对加标血清中LNZ回收率（RC）和变异系数（CV）的影响（n = 4）
5、实际样本分析
对2例伴有MRSA/VRE感染的手术患者的血清样本（n=36）预处理，进行dc-ELISA检测。用抗原包被模式的两种方案进行检测，第一种为anti-H1抗体（零间隔臂半抗原）和Hapten 4 -TTD(50:1)抗原（最长间隔臂半抗原），第二种为anti-H3抗体（最长间隔臂半抗原）和Hapten 1-GOD(50:1)抗原（零间隔臂半抗原），测定患者服药24、48h时血清中LNZ的含量（图4A,B）。结果表明两种不同的检测方案检测一致性较强（图4C），这些数据相互证实了检测的充分性，并论证了不同间隔臂长度的半抗原不会影响检测性能。
【总结】
本研究使用不同间隔臂长度的半抗原进行dc-ELISA检测方法的构建，开发出三种检测方案anti-H1+Hapten 4-TTD(50:1)、anti-H3+Hapten 1-GOD(50:1)和anti-H2+Hapten 4-TTD(50:1)，并具有相似的检测特性。IC50为11.5-28.3 ng/mL，检测限为0.5-1.6 ng/mL，线性范围较宽，使用TCA预处理的分析物回收率最高可到达到82.1-99.6%，为临床上即时检测患者体内LNZ含量提供了可靠的检测手段。
【原文出处】
Burkin MA, Tikhomirov AS, Surovoy YA, Galvidis IA. Hapten Synthesis, Antibody Generation, and Immunoassay Development for Linezolid Therapeutic Monitoring. Anal Chem. 2024 Oct 23.
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c04537
指导教师：王战辉
抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展，欢迎投稿。点击下方轻松关注！
