摘要
本文报道了一种可用于产生具有不同抗原识别和理化性质兔单链抗体（scFv）的CDR移植技术。通过CDR移植构建的抗CRP（C反应蛋白） scFv——C1R/B1R（V1），是由基于传统编号规则的CDR/框架区域（CDR/FR）定义产生的，但其与原始克隆C1R相比亲和力显著降低，这表明原始CDR之外的氨基酸残基可能促进兔scFv中的抗原识别。本文从噬菌体文库中分离的兔scFv的氨基酸序列比对，重新定义了新的CDR和FR，通过CDRH1和CDRH2的多个氨基酸残基的扩展来维持抗原结合亲和力。新的定义成功维持了抗原结合亲和力。基于新的CDR/FR定义，成功生成了具有共同CDR序列但FR序列不同的scFv，并进一步研究了它们的物理化学性质。这些兔scFv对使用Maxisorp酶标板开展夹心ELISA中测试的结合力表现有所不同，这表明相同的CDR与不同FR的组合可能会改变scFv在固相材料上的理化性质。本研究开发的方法有望生成具有高度抗原结合识别能力和不同理化性质的抗体材料。
前言
作者以前的研究成功分离和表征了来自噬菌体文库的兔scFv抗体，用于免疫亲和层析和乳胶比浊免疫测定。从文库中筛选的scFv在理化性质上差异很大，例如表达水平、pH稳定性和固定后的残留活性，以及在溶液中的抗原结合亲和力和特异性。这些结果表明，不仅scFv的CDR存在差异，而且FR的氨基酸序列也存在差异，这极大地影响了三维结构的形成，可能导致分离的scFv克隆具有独特的理化性质。因此，需要专门用于免疫诊断测试开发的兔scFv克隆的表征和进化的新方法。
CDR移植是解决小鼠抗体人源化用于治疗目的的最有吸引力方法之一。CDR移植是指将抗原特异性CDR转移到另一个抗体框架的过程，其中CDR移植之后的抗体必须保持与原始抗体相似的抗原结合活性。为了降低免疫原性，CDR移植已被广泛用于将小鼠的CDR移植到人抗体FR中。值得注意的是，该方法于2019年成功用于开发brolucizumab，一种scFv形式的兔人源化单克隆抗体，以靶向血管内皮生长因子A进行癌症治疗。通常CDR和FR的区域由IMGT编号方法确定。对于CDR移植重要的是受体与供体框架具有高度同源的框架区域。此外，据报道，基于基因序列定义的CDR与实际抗原相互作用的区域之间存在不可预测的差异。因此，在保持原始抗原特异性和亲和力的同时，需要大量的精力和时间来替换抗体的框架序列。
另一方面，也有报道称，抗体或抗体片段中CDR和FR的不同组合会改变其生物物理特性，从而影响表达水平和纯化过程。迄今为止，研究侧重于兔抗体人源化，但尚未有报道调查CDR移植兔scFv的特性。
本研究的目的是开发一种高效且多功能的CDR移植技术，用于生成具有不同理化性质和抗原结合特异性的兔scFv。首先，重新定义了CDR/FR边界，以确保在CDR移植后能保持兔scFv的抗原结合亲和力和特异性。然后，表征了具有不同氨基酸序列的CDR移植scFv。检查了固相化后scFv的抗原结合活性、它们与Protein L亲和柱结合的能力以及它们在大肠杆菌培养物中的表达水平。通过这些研究，证明了本文开发的CDR移植技术有可能产生具有不同物理化学性质的新型兔scFv。
研究内容
1. CDR/FR定义适用于兔scFv的CDR移植
研究了CDR/FR合适的新定义，能够在对兔scFv CDR移植时提供足够抗原结合亲和力和特异性。通过将抗CRP scFv（C1R）的CDR核苷酸序列引入抗NP-B scFv（B1R）的FRs的核苷酸序列，构建CDR移植的scFv基因和C1R/B1R作为模型。通常，IMGT编号方法是确定VH和VL结构域中CDR和FR区域的已知标准，适用于各物种。因此，按照IMGT编号规则合成了CDR移植的scFv基因C1R/B1R（V1）作为原型。
Fig.S1显示了之前的研究中鉴定出来的26个不同VH结构域的氨基酸序列，并使用IMGT编号方法进行比对。位于CDRH1和CDRH2附近的氨基酸残基（黄色标出）高度多样化。Fig.S2中，在VL中未观察到CDRs周围氨基酸的明显多样性。先前的多项研究报道，CDR周围的氨基酸残基会影响CDR环的构象以及抗原结合。因此，预计CDRH1和CDRH2周围的氨基酸残基将直接或间接地促进抗原识别。基于这个假设，使用新的CDR/FR定义V2（Fig.S3）构建了另一种CDR移植的scFv C1R/B1R（V2）。基于这个新定义，新设计的CDR移植scFv C1R/B1R（V2）上的CDRH1位于H26和H40之间，而CDRH2位于H52和H66之间，如Fig.S2所示。因此，C1R/B1R（V2）中FR与原始scFv C1R的氨基酸序列同源性为94.1%，比C1R/C2R（V1）中发现的氨基酸序列同源性高2.6%，如Table.S2所示（Table.S2未展示）.
Fig.S1 26种不同兔源scFv VH结构域的氨基酸序列
Fig.S2 26种不同兔源scFv VL结构域的氨基酸序列
Fig. S3基于IMGT定义（V1）和新的CDR/FR定义（V2）的原始scFv和CDR移植scFv的氨基酸序列
Fig.1显示两种不同CDR移植的scFv的抗原结合活性，通过间接ELISA测定。与用作阳性对照的原始scFv C1R相比，C1R/B1R（V1）对抗原CRP的抗原结合活性水平不足。这些结果表明基于IMGT编号规则的常规CDR定义V1可能不足以维持抗原结合识别，就像原始克隆一样。相比之下，使用新的CDR/FR定义V2设计的CDR移植scFv C1R/B1R（V2）的抗原结合活性被发现显着改善，并且与原始scFv C1R相似。使用SPR传感器进一步分析两种CDR移植的scFv，包括动力学速率常数（kon和koff）和解离常数（KD）。如Table.1，C1R/B1R（V2）显示出足够的抗原结合亲和力，具有与原始克隆相似的KD值，而C1R/B1R（V1）的KD为3.08×10−8M比原始scFv高约240倍。这些结果表明基于IMGT编号规则的CDR/FR定义不足以用于兔scFv克隆之间的CDR移植。为了研究CDR移植与改进的CDR/FR定义V2的适用性，Table.S1列出了制备了（A1R/B1R（V2）、C1R/C2R（V2）、A1R/C2R（V2）和A3R/C2R（V2））。因此，证实V2定义的CDR移植scFv的抗原结合活性和特异性被充分保留（数据未显示）。
Fig.1间接ELISA，与原始scFv相比，移植scFv的抗原结合特异性
Table.1原始scFv和CDR移植的scFv与CRP结合的动力学参数。
Table.S1本研究制备的CDR移植scFv。
*CDR/FR定义，V1是根据IMGT编号规则定义的。
本研究根据序列比对结果进行了另一种V2定义
Table.S2 scFv克隆的氨基酸序列同源性
2.夹心ELISA中具有不同框架的CDR移植scFv的表征
将C1R、C1R/B1R（V2）和C1R/C2R（V2）三种不同FR组成的抗CRP scFv固定在平板上，并使用夹心ELISA比较它们的抗原结合活性。如Fig.2A，固定在板上的3个scFv可以特异性地检测出具有足够信号强度的抗原，而使用CDR移植的scFv和C1R/C2R（V2）获得的信号略高于原始scFv和C1R。板上C1R/B1R（V2）的抗原结合信号明显低于原始克隆C1R的抗原结合信号，而它们在溶液中对抗原的抗原结合亲和力几乎相当，如下Fig.1和Table.1所示，这些结果表明CDR移植的scFv在固定到板上后的剩余活性可能取决于FR的吸附程度和/或构象变化。Fig.2B显示了另一种使用具有三种不同FR（A1R、A1R/B1R（V2）和A1R/C2R（V2））的抗NP-A scFv的夹心ELISA。在具有3种不同FR的抗NP-A scFv中，发现CDR移植的scFv A1R/C2R（V2）在平板上的抗原结合活性最低。这些发现表明，CDR和FR的组合可能会改变scFv的物理化学性质，例如它们在固体载体上的吸附特性和物理稳定性。据报道，Fv结构域的物理稳定性和折叠效率取决于小鼠和人抗体中CDR和FR之间的相容性。因此，兔框架的高度多样性有可能产生具有新颖物理化学性质和精确抗原结合亲和力和特异性的scFv。
Fig.2通过夹心ELISA检查,与原始克隆相比移植scFvs的抗原结合活性。（A）抗CRPscFvs。（B）抗NP-A scFv。
3. 通过CDR移植产生可能具有Protein L结合能力的兔scFv
报道称，Protein L亲和柱不适用于兔多克隆抗体的亲和纯化，因为兔抗体对Protein L的平均结合亲和力不够高。正预期的那样，在之前的研究中分离的几乎所有兔Scfv都几乎没有显示出在Protein L亲和柱上足够的吸附保留；因此，它们无法通过亲和层析进行纯化（数据未显示）。相比之下，在以前的研究中从噬菌体文库获得的一些克隆，例如抗CRP scFv——C2R，是可能对Protein L具有强结合亲和力的scFv。
如Table.2，Protein L亲和层析回收了80%以上的C2R和C1R/C2R（V2）应用，表明C2R母体框架在C1R/C2R（V2）中的Protein L结合能力，即使在CDR移植后也成功保留。
Table.2 在Protein L亲和层析中对每个组分进行蛋白质定量。
制备了三种具有C2R框架的不同CDR移植scFv克隆（A3R/C2R（V2）、A1R/C2R（V2）和C1R/C2R（V2）），以评估C2R框架scFv克隆在基于Protein L的亲和纯化过程中的适用性和多功能性。结果发现Protein L亲和柱回收的C2R框架scFv的量，如C2R、A3R/C2R（V2）、A1R/C2R（V2）和C1R/C2R（V2），与从Ni-NTA亲和柱回收的量相当或更高（Fig.S6）。因此，C2R框架可能具有在多种兔scFv克隆中提供Protein L结合能力的潜力。随后，预计即使在CDR移植之后，兔scFv的原始框架可能具有的生物学功能和/或物理化学性质也将得到维持。Protein L结合Ig轻链结构已被证明在哺乳动物进化过程中是保守的，并且表现出对人Vk3和小鼠Vk1κ轻链的结合亲和力。此外，CDR移植的scFv通过FR取代获得增强的结合能力，表明Protein L主要识别兔scFv的VL结构域。
4. CDR移植scFv的表达滴度和溶解度
为了研究FR序列差异对scFv产生的影响，比较了培养物中原始scFv和CDR移植scFv的表达滴度。如Table.3，在测试的原始克隆中观察到的原始scFv和C2R具有最高的总表达滴度，而C2R框架的scFv的总表达，即A1R/C2R（V2）、A3R/C2R（V2）和C1R/C2R（V2），往往低于原始scFv。有趣的是，研究还发现，所有C2R框架的scFv中的不溶性蛋白量均显著降低，因此，A1R/C2R（V2）和A3R/C2R（V2）的溶解度得到提高。C1R/C2R（V2）的溶解度略低于C1R，因为它在可溶性和不溶性组分中的表达都急剧降低。这些结果清楚地表明，CDR移植scFv的表达特性，例如它们在宿主细胞中的折叠、聚集和降解速度，可能受到CDR和FR氨基酸序列的强烈影响。因此，有必要用各种框架对scFv进行表征，并且预计通过确定具有特殊物理化学性质的框架序列，将提供更高的生产率、溶解度和热稳定性。
Table.3 C2R框架scFv的表达滴度和溶解度。
结论
综上所述，本文使用基于IMGT编号规则的新CDR/FR定义（V2）成功开发了兔scFv的CDR移植技术。根据26个分离的兔scFv的序列比对分析，CDRH1和CDRH2的区域被扩展。CDR移植的scFv C1R/B1R（V2）能够特异性结合抗原，在间接ELISA和SPR分析中与原始scFv C1R相当。相反，基于常规IMGT编号定义的CDR移植scFv的解离常数（KD）比原始scFv大约差240倍。
本研究中开发的兔scFv的CDR移植技术有可能产生具有严格抗原结合识别和不同特性的替代品。确定CDR移植scFv中CDR和FR的最佳组合，可以保留抗原结合区域，这将有利于使用具有特殊功能的通用框架模板创建兔scFv。为了生产具有良好理化性质和强抗原结合能力的兔scFv，仔细筛选和表征从不同兔抗体文库获得的框架序列至关重要。因此，具有特殊功能和/或特性的框架的筛选、鉴定和表征将有助于生成具有理想物理和/或生物特性的兔scFv。
原文出处：Nguyen NM, Nakao K, Kobayashi R, Taniguchi H, Yokoyama F, Horiuchi JI, Kumada Y. Generation of rabbit single-chain variable fragments with different physicochemical and biological properties by complementary determining region-grafting technology. J Biosci Bioeng. 2024 Aug 27:S1389-1723(24)00198-1.
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1389172324001981
指导教师：王战辉
