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摘要：聚吡咯（Polypyrrole，Ppy）是一种具有生物相容性的导电聚合物，通常作为整合药物和酶的载体。本研究提出了一种新型Ppy的应用方式——将其制成含有抗体（Ab）的生物识别薄膜——具有取代传统的、需要多步骤的“硫醇基自组装单层技术”的应用潜力。该方法先将混合后的吡咯和抗体滴涂至电极表面，再进行直流电聚合，最终形成了薄膜。随后，使用荧光显微镜和电化学技术对抗体的固定效率进行评估；结果显示，在1min内，抗体密度显著提升，抗体固定被成功实现。以α-胎蛋白为测试目标，该免疫传感器展现了卓越的性能，其检测限达3.13pg/mL，信号范围为1pg/mL-100ng/mL。本文利用电化学手段对生物分子进行表面修饰或固定，使其能够在电化学传感器中发挥作用，展现出生物分子的高亲和力及快速电化学功能化的潜力。
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【引言】
使用电化学免疫传感器分析复杂混合物（如体液）中目标分析物，已被用于疾病诊断、环境监测和单细胞监测。生物识别层（如抗原-抗体互作层），对免疫传感器的特异性至关重要，提高电极表面抗体量可以增强灵敏度和特异性。使用自组装单分子层（SAM）进行表面改性的传统方法存在局限性，如仅限于硫醇修饰的金衬底，形成时间长，且未考虑固定化抗体的表面密度。为了克服这些限制，研究者设计了一种基于吡咯电聚合的抗体固定化方法，利用Ppy的生物相容性和固定多种生物分子的能力，通过一步法在电极表面形成高密度的Ab-Ppy层。通过以α胎蛋白（AFP）为模型分析物的定量分析，证明了该免疫传感器的可行性。AFP作为疾病诊断的重要生物标志物，其检测限达到3.13 pg/mL，并对传感器的特异性、稳定性和可重复性进行验证。![]()
图1.（a）基于吡咯电聚合的各类固定化示意图。（b）基于Ppy复合膜的Ab固定化构建过程示意图。（c）基于SAMs的抗体识别层的构建。
【实验方法】
1.试剂和化学品的准备：抗人AFP抗体和AFP抗原、IL-6抗体和IL-6抗原等生物分子，以及吡咯单体、化学交联剂、缓冲液等化学品。
2.仪器和电极的准备：使用金丝网印刷电极（SPE）和其他辅助电极，所有电化学（EC）测量在室温下、法拉第笼中进行。
3.电极制造：通过电子束蒸发技术在硅片上制造电极，并使用光刻胶增加传感器灵敏度。
4.Ab-Ppy SPE的构建：预清洁电极，通过电聚合在电极上固定抗体，形成Ab-Ppy复合层。
5.Ab固定：使用共价键合的方法，通过11-巯基十一烷酸（11-MUA）形成的自组装单分子层（SAM）在电极上固定抗体。
6.Ppy改性电极的表征：使用共聚焦显微镜观察荧光标记的抗体分布，利用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）进行形态和元素分析，通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和拉曼光谱进行材料表征，进行循环伏安（CV）、线性扫描伏安（SWV）和电化学阻抗谱（EIS）等电化学表征。
7.统计方法：实验数据进行多次测定，计算平均值和标准偏差，使用Origin软件进行图形绘制和数据分析。
【结果】
1.Ab-PPY复合层的制备与表征：
通过电聚合吡咯（Ppy）的方法在电极上成功制备了Ab-Ppy复合层，共聚焦荧光图像显示，在添加抗AFP抗体的情况下，Ppy层广泛观察到荧光强度，证实了Ab-Ppy识别层的形成，FTIR和拉曼光谱结果确认了Ppy的存在和在电极上的形成。![]()
图2.
DceP用变化电位的Ab-Ppy复合膜和用SEM测定的电极与Ab-Ppy复合膜的共聚焦荧光图像。标记山羊抗小鼠IgG（使用Alexa Fluor 488）
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图3.（a） Ppy在电极上的机理和（b） FTIR和（c） Ppy薄膜的拉曼光谱。
2.为了全面评估聚吡咯（Ppy）电化学（EC）免疫传感器的性能，进行了一系列的电化学特性测试，并优化了实验条件。
采用循环伏安法（CV）和线性扫描伏安法（SWV）调整直流电聚合（DCeP）的电位，在400至500 mV的DCeP电位下，EIS曲线和阻抗值在1至10 kHz频率范围内上升。当DCeP电位达到550 mV时，阻抗值降低，表明形成了具有较高电导性的Ppy层。本研究特别关注低频区域的阻抗变化。Ag与电极上的Ab-Ppy识别层的结合所产生的EC信号主要由界面电容控制，这也是在作者先前研究中使用的4至100 Hz低频EIS免疫传感器的依据。在优化Ppy和记录条件后，获得EDS光谱，定量分析了制备的Ppy薄膜和Ab-Ppy复合膜的元素组成。表1.Ppy薄膜和Ab-Ppy复合膜的元素组成
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随后该研究进行了非法拉第EIS测试。与Au基线相比，Ab-Ppy固定后阻抗值的显著降低归因于Ppy层加速了传感界面的电子转移。使用1：10的胎牛血清（FBS）溶液处理后，阻抗有所增加，进一步验证了非特异性结合的阻断效果。随后，AFP的特异性Ag与电极上的Ab-Ppy层孵育，由于AFP的低电导率，阻抗进一步上升。这些阻抗的变化记录证实了免疫传感器的有效性。最后，通过在10 mM PBS中对不同浓度的AFP进行固定后的非法拉第EIS测试，成功表征了Ab-Ppy免疫传感器的传感性能。在10 mM PBS和10% FBS中对不同浓度的AFP进行测试，证实了免疫传感器对AFP的高灵敏度和特异性。表明传感器具有良好的重复性、再现性，以及优异的长期稳定性。在与其他传感器比较，Ab-Ppy复合膜免疫传感器在抗体固定时间、灵敏度和选择性方面展现出显著优势，特别是其“快速包被”的特性。【小结】
通过电聚合吡咯的方法制备的Ab-Ppy复合层可以作为一种高灵敏度、高特异性的电化学免疫传感器，用于快速、稳定地检测AFP，具有在临床诊断和生物医学领域应用的潜力。【原文出处】
USun
Nam, Han Na Suh, Sang-Keun Sung, ChaeWon Seo, Jung Hyun Lee, Jeong Yoon Lee,
SangHee Kim, and JuKyung Lee.ACS
Applied Materials & Interfaces 16 (24),
30611-30621（2024）
指导教师：王战辉
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