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传统单色信号读出的侧流免疫层析（LFIA）存在颜色变化模糊和单色模式读数受限的问题，难以满足高性能检测的需求。受彩虹多种颜色的启发，本研究使用多枝化三金属铂-铑-钴纳米颗粒（PRCNP）作为新型信号标记物构建了一种多色读出LFIA。PRCNPs的自身优异的多功能性使其在催化活性、抗体偶联及信号读出方面具有显著优势。基于PRCNPs介导的纳米酶催化反应及催化产物对金纳米棒刻蚀反应的协同整合，PRCNPs-LFIA能实现以彩虹般的多色方式进行信号读出。基于PRCNPs的LFIA可对低至2
ng mL-1的啶虫脒（ACE）进行定性分析。同时，它还提供基于10种不同颜色的半定量分析读出，在0.01-10
ng mL-1范围内进行定量，检测限最低可达0.006 ng mL-1。PRCNPs-LFIA 在灰度模式和多色读出下可实现对食品样品中ACE精准检测。本研究验证了多功能PRCNPs在多色读出LFIA开发中的潜力，为新型LFIA检测体系的构建提出了一种新策略。Scheme（A）基于单色信号的传统LFIA所面临挑战的示意图。（B） 基于PRCNPs的多色读出LFIA检测ACE的示意图。成果简介
PRCNPs的合成和表征
基于溶剂热法合成了多枝化三金属PRCNPs。并通过SEM和TEM对PRCNPs的形态进行了表征。结果表明PRCNPs的平均粒径约为113.8 nm，呈球形且表面存在诸多突起结构。PRCNPs实测晶格间距为0.224 nm，与其结构中（111）晶面对应。对30天内PRCNPs的水化粒径和PDI进行了持续性监测，这两个参数都没有发生显著变化，表明PRCNPs具有良好的分散稳定性。EDS元素能谱面扫和线扫描结果证实Pt、Rh和Co元素在PRCNPs结构中分布，各元素质量分数分别为59.63%、33.06%和7.31%。XRD图谱表明了PRCNPs具有(111)、(200)、(220)和(311)典型的立方晶体结构，表明三金属PRCNPs合成成功。XPS表明PRCNPs由 Pt、Rh和Co的表面元素组成。Pt4f、Ru3d和Co2p的高分辨率XPS能谱表明PRCNPs中Pt0、Rh0和Co0与Co2p标准XPS相比，Co0 2p的结合能呈正偏移。相反，与标准XPS峰相比，PRCNPs中金属 Pt0 4f和Rh0 3d的结合能都出现了负偏移。电子结构的这些变化主要源于从Co到Pt和Rh元素之间的电子转移，其削弱了催化中间产物在活性位点的吸附，提高了PRCNPs催化效率。PRCNPs 的催化性能表征
对于多色读出LFIA而言，信号标签的催化能力在刻蚀产物生成过程中具有重要作用。以TMB底物评估了PRCNPs的催化性能。PRCNPs只有在H2O2存在下才可氧化TMB生成oxTMB，证明PRCNPs具有过氧化物酶活性。此外，随着PRCNPs浓度增加，混合反应液颜色强度增强，652nm处的吸光度也增强。为对PRCNPs的催化性能进行全面考察，对PRCNPs对TMB和H2O2的米氏动力学方程进行了绘制，计算了相应的米氏常数Km和最大反应速率Vmax。结果表明，PRCNPs对TMB的Km和Vmax值分别为0.3899
mM和17.09×10-8M s-1，而对H2O2的 Km和Vmax 值分别为2.871
mM和11.69×10-8M s-1。与HRP和其他纳米酶相比，PRCNPs表现出极佳的底物亲和力和催化速率，证明了其作为LFIA体系中高效催化剂的潜力。为阐明PRCNPs催化机制，利用ESR光谱监测催化过程中产生的活性氧种类。结果表明，ESR光谱呈现典型的1:2:2:1信号峰强度，为-OH的特征峰，表明-OH自由基在催化中有重要作用。进一步考察了PRCNPs储存稳定性和可重复使用性。PRCNPs储存20天后催化活性保持在93%以上。此外，重复5个周期后PRCNPs相对催化活性保持在83%以上，证明了PRCNPs具有良好的储存稳定性和可重复使用性。
图2. 多枝化三金属PRCNPs的过氧化物酶样活性考评LFIA中信号标记物能有效偶联抗体并将免疫反应信号转化为可检测信号。而具有不规则三维结构的纳米颗粒具有更大的比表面积，光吸收能力更强，具有更多抗体结合位点和更强的光学信号。为评估PRCNPs在LFIA中作为信号标签的潜力，比较了PRCNPs和胶体金纳米颗粒（GNPs）的抗体偶联效率和内在光学信号输出能力。通过ELISA方法建立了抗体浓度与吸光度之间的回归方程。GNPs抗体偶联效率在71.08%到99.73%之间，而PRCNPs的抗体偶联效率在85.56%到99.78%之间。随后，测定了30天内 PRCNPs-mAb探针的水化动力学直径和PDI，结果显示，这两个参数仅有轻微变化，表明PRCNPs-mAb探针具有良好保存稳定性。为考察PRCNPs-mAb和GNPs-mAb探针将免疫识别信号转化为LFIA光学测信号的能力，比较了不同抗体用量下PRCNPs-mAb和GNPs-mAb光学信号强度。相同抗体用量下，PRCNPs-mAb探针在T线上的信号强度明显高于GNPs-mAb，表明两种探针产生相同信号强度时，PRCNPs所需抗体量比GNPs少，进一步比较了PRCNPs和GNP在可见光范围内的光吸收能力。GNPs在528 nm处有明显吸收峰，而PRCNPs表现出广谱可见光吸收。同时，与酒红色的GNPs相比，黑色的PRCNPs在NC膜上呈现更强的信号对比度。通过计算PRCNPs和GNPs在400-800 nm范围内吸收谱积分面积来量化其可见光吸收性能。PRCNPs的积分面积是GNPs的3.2倍，表明PRCNPs光吸收能力更强，相同颗粒浓度的PRCNPs和GNPs在硝酸纤维素膜上的平均灰度强度PRCNPs是GNPs的2倍，进一步证明了PRCNPs优异的光学性能。这些结果表明，与传统GNPs相比，PRCNPs的光学性能和信号输出效率都有所提高。
图3. 多枝化三金属PRCNPs和传统GNPs作为LFIA信号标签的比较单色LFIA用于ACE检测的实际性能
ACE是一种广谱杀虫剂，其不当使用会导致残留造成一系列食品安全事件。因此迫切需要开发一种简单、快速的方法监测ACE残留。首先建立了三种单色信号读出的LFIA：基于GNPs的LFIA（GNPs-LFIA）、基于PRCNPs本征颜色的LFIA（单色PRCNPs-LFIA）和基于PRCNPs催化增强的LFIA（PRCNPs-C-LFIA）。在最佳条件下，随着ACE浓度增加，GNPs-LFIA的cut-off为10 ng mL-1。对于单色PRCNPs-LFIA，其cut-off为2 ng mL-1。值得注意的是，在催化增强的LFIA中，oxTMB的沉积会使T线上最初看不见的颜色变暗，从而影响检测的cut-off值。PRCNPs-C-LFIA的cut-off为50 ng mL-1。与GNPs-LFIA和PRCNPs-C-LFIA相比，基于PRCNPs本征颜色的PRCNPs-LFIA的cut-off分别提高了5倍和25倍，表明PRCNPs作为信号标签可提高定性分析灵敏度。而后，根据T线灰度值对单色检测进行了定量分析。GNPs-LFIA的线性范围为0.1至 2 ng mL-1，LOD为0.098 ng mL-1。同样，单色PRCNPs-LFIA的线性范围为0.05-
2 ng mL-1，LOD为0.044 ng mL-1。PRCNPs-C-LFIA的线性范围为0.02至10 ng mL-1，LOD为0.019 ng mL-1。与GNPs-LFIA相比，单色PRCNPs-LFIA的线性范围和LOD更优。此外，与GNPs-LFIA和单色PRCNPs-LFIA相比，PRCNPs-C-LFIA扩大了线性检测范围，且LOD有所改善但牺牲了cut-off。![]()
图4. 单色读出LFIA检测ACE的分析性能
用于ACE检测的多色LFIA分析性能
为实现T线从单色强度到多色变化的信号转换，通过将PRCNPs催化过程与催化产物对金纳米棒（GNRs）的蚀刻反应相结合，实现了彩虹般的多色信号读出LFIA。加入H2O2后，具有过氧化物酶样活性PRCNPs将TMB催化为oxTMB+。随后加入的H+促进了oxTMB+向TMB2+的转化，引发了GNR不同程度蚀刻，从而产生多种颜色。当PRCNPs、TMB、H2O2和H+共存时，GNRs的纵向局域表面等离子体共振（LSPR）峰会发生蓝移，并伴随着可见的颜色变化。随着PRCNPs浓度的增加，GNRs的纵向LSPR峰蓝移增强，溶液呈现出棕色、绿色、蓝色、紫色和粉红色一系列颜色变化。TEM图像证实了蚀刻后GNRs形态变化。在最佳催化和蚀刻条件下，单色LFIA转化后呈现出浓度依赖性的颜色变化。而后，设计了代表不同浓度ACE的颜色识别卡，显示出至少10种肉眼可识别的不同颜色。这些卡片通过颜色识别实现了对ACE的半定量检测，类似于pH试纸。进一步通过四种主要色彩空间（包括RGB、CMYK、Lab和HSB色彩模型）进一步量化多色LFIA的色彩变化。分析色彩空间中一个或多个组成成分的变化是比色分析定量的常用方法。对于色彩变化的测量，欧氏距离是一种实用的度量方法，它代表了同一色彩空间中两种颜色之间的实际距离。在本研究中，不同颜色空间中的多色PRCNPs-LFIA欧氏距离与ACE浓度相关。对于RGB色彩空间，在0.01至10 ng mL-1的范围内两个独立的线性关系：0.01-0.2 ng mL-1和 0.2-10 ng mL-1的回归方程分别为Y1=35.23 log(X1)+121.9（R2=0.9942）和Y2=-57.21 log(X2)+56.56（R2=0.9807），LOD为0.009 ng mL-1。同样，在CMYK色彩空间中，0.01-10 ng mL-1范围内两个独立的线性关系范围为0.01-0.2 ng mL-1和0.2-10 ng mL-1，回归方程为Y1=13.75 log(X1)+52.37（R2=0.9976）和 Y2
=-23.46 log(X2)+26.32（R2=0.9864），LOD为0.006 ng mL-1。在Lab颜色空间中，0.01-10 ng mL-1范围内有两个独立的线性关系0.01-0.2 ng mL-1和0.2-10 ng mL-1，回归方程为Y1=20.61 log(X1)+60.07（R2=0.9808）和Y2=-25.54 log(X2)+26.70（R2=0.9615），LOD为0.009 ng mL-1。此外，由于构成HSB色彩空间的三个单独通道（H、S和B）没有系统性变化，因此无法在PRCNPs-LFIA中识别色彩变化。综上，多色读出PRCNPs-LFIA在检测ACE时表现出较高的灵敏度和较宽的线性范围。其cut-off比GNPs-LFIA低5倍，比PRCNPs-C-LFIA低25倍。通过蚀刻GNRs进行多色读出，与GNPs-LFIA、PRCNPs-LFIA（单色）和PRCNPs-C-LFIA相比，多色读出PRCNPs-LFIA的LOD显著降低。与其他ACE LFIA方法相比，PRCNPs-LFIA具有灵敏度高、线性范围宽、可同时进行定量、半定量和定性检测等优点。通过检测九种干扰农药评估了多色读出PRCNPs-LFIA的特异性，结果表明即使在浓度比ACE高10倍的情况下，其他农药也会在T线上显示出明显黑色条带，证明了PRCNPs-LFIA的检测特异性。![]()
图 5. 多色读出PRCNPs-LFIA检测ACE的分析性能
基于PRCNPs的LFIA在食品样品中的应用
为评估PRCNPs-LFIA的实用性，选择了蜂蜜、萝卜和梨样本进行了检测。首先考察了PRCNPs-LFIA在三种添加浓度（0、8和550 ng g-1）下对ACE的检测。随着ACE浓度增加，T线颜色减弱，灰度强度下降。随后，引入了GNR蚀刻将单色信号转换为多色信号，溶液呈现出不同颜色，肉眼很容易区分。根据不同颜色，在RGB、CMYK和Lab色彩空间中对结果进行了定量。对于相同ACE浓度的三个样品，不同颜色空间欧氏距离相似，但对于不同浓度的ACE则显示出明显差异。结果表明，PRCNPs-LFIA可用于不同食品样品中ACE检测。为验证其准确性，进一步使用灰度强度和三重色彩空间（RGB、CMYK和Lab）计算了三种食品样品中回收率。经计算，PRCNPs-LFIA在灰度、RGB、CMYK和Lab 模式下的回收率分别为87.35%-103.59%、85.56%-114.33%、86.14%-114.77%和87.81%-112.01%，CV均低于15%。结果表明，PRCNPs-LFIA可用于食品样品中ACE检测。图 6. PRCNPs-LFIA在检测实际样品中ACE的应用
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本研究设计了一种基于PRCNPs的多色信号读出LFIA。基于PRCNPs的优异性能。通过引入GNRs刻蚀，PRCNPs-LFIA可将传统单色信号转换为多色信号输出，革新了传统LFIA的信号读取模式。多色读出PRCNPs-LFIA可以直接对ACE进行定性分析，同时基于颜色识别卡进行半定量分析，以及在多种颜色空间中进行定量分析，灵敏度更高，线性范围更广。通过实际样本验证，PRCNPs-LFIA已成功用于检测食品样品中的ACE残留检测。本研究为新型LFIA检测平台创制提供了一种具有前瞻性的工具。![]()
Wang, Z., Fu, R., Hou, J., Hu, H., Yi, J., Yang, P., Zhou,
R., XianYu, Y., & Guo, Y. Rainbow-inspired multicolor lateral flow
immunoassay using multibranched platinum-rhodium-cobalt nanoparticles.Chemical Engineering Journal, 2024. 155084.https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.155084指导老师：王战辉
抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展
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