摘要
本团队选择阿维菌素(ABM)来探明半抗原设计和抗体识别特性对小分子夹心免疫测定的影响。首先,作者对ABM的表位进行了粗略定位,并确定了表位距离。然后,分别在ABM上引入两个间隔臂,设计了旨在提供最长表位距离的两个半抗原。对可以同时结合ABM的抗体对进行了广泛的排列组合,并且仅观察到两个单抗 - 单抗对可以实现对ABM的夹心免疫分析,总成功率为0.27%。通过表面等离子体共振(SPR)确定最佳单克隆抗体对,建立夹心免疫分析法,并与结构相似的类似物和ABM进行交叉反应和分子对接。总之,该研究证明了严谨的半抗原设计和广泛的抗体筛选对于成功建立小分子夹心免疫分析法的重要性,并为实际操作提供了理论基础和实践经验。正文
竞争性免疫分析中的分析物与标记的类似物竞争有限抗体,而与竞争对手相反,夹心免疫分析法利用冗余的抗体来促进Ab-Ag-Ab复合物的形成,通常有更高的灵敏度、特异性和更宽的线性范围。夹心免疫分析要求分析物至少有两个可以同时结合至少两种抗体的表位。然而,由于空间位阻的限制,小分子通常被认为是单价的,如抗生素、农药和真菌毒素,它们不能同时与两种抗体结合。因此,夹心免疫分析法主要用于大分子(如蛋白质)的检测,而竞争性免疫分析法则主要用于小分子的检测。由于所用抗体亲和力有限,小分子竞争性免疫测定常常难以满足高灵敏度和特异性的需要。最近,本课题组利用线性模型分子探索了夹心免疫测定的表位极限,发现一个小分子可形成夹心法的两个表位之间的距离极限仅为2.4 Å;当一个小分子的表位距离大于8.8 Å时,开发夹心免疫分析的成功率大大提高。因此,开发具有一定表位距离的小分子夹心免疫分析法在理论上是可能的。阿维菌素是一种从链霉菌中分离得到的广泛应用于兽医临床和农业杀虫剂中的大环化合物,分子量为873 Da。本研究以ABM为模型分子,评估半抗原设计和抗体识别特性对夹心免疫测定发展的影响。作者研究的目的是制备能够识别ABM的两个独立表位的抗体,并筛选抗体对,用于开发真正的ABM夹心免疫分析法。半抗原的设计是确定抗体性质的关键步骤之一。间隔臂应该在ABM的两个独立的位点上有足够的距离,以最大限度地使ABM的特征表位暴露于免疫系统。首先,根据ABM的分子结构进行表位分析,定位ABM的表位。如图1A所示,ABM的16元内酯环大致可以分为三个部分,并定义为三个可能的表位:绿色抗原决定基团A,有 C13活性羟基;黄色抗原决定基团B,包含活性羟基C5和C7;紫色的抗原决定基C结构不包含任何活跃的成分,这表明它不能结合到载体蛋白。图1所示。推断ABM的表位、ABM的表位距离以及ABM-4和ABM-5半抗原的化学结构。(A)表位A为绿色,表位B为黄色,表位C为紫色。(E和F)半抗原ABM-4和ABM-5的化学结构,以及引入间隔臂用绿色和黄色表示。
半抗原设计
然后,根据ABM的三维结构,计算出ABM的最小能量构象,得到三个表位成对组合的表面积和间距。如图1 B−D所示,表位A、表位B和表位C的表面积分别为318.99、201.62和293.36 Å2,足以构成一个单一的表位;确定表位A与表位B、表位A与表位C、表位B与表位C之间的距离分别为6.3、4.9和3.7 Å。根据课题组之前的研究,两个距离仅为2.4 Å的被分析物的两个表位可以同时被两个单抗结合,而对于距离超过8.8 Å的两个表位,夹心免疫分析法的成功率很高。显然,表位距离为6.3 Å的表位A和表位B是最适合对ABM进行夹心免疫测定的。然而,由于位阻,表位B上的C7−OH很难直接反应。因此,作者设计了两个半抗原(图1E,F),分别在ABM的C5 - OH和C4″- OH处引入以羧基结尾的间隔臂,命名为ABM-5和ABM-4,这两个半抗原经质谱和核磁共振鉴定表明半抗原成功合成。抗体的产生和鉴定
半抗原ABM-4和ABM-5通过活性酯法与载体蛋白(KLH、BSA或OVA)偶联。用BSA和KLH免疫原免疫新西兰大白兔,用KLH免疫原免疫BALB/c小鼠。兔多克隆抗体的鉴定。多抗抗血清效价采用非竞争性ELISA法(ncELISA)表征,亲和力采用竞争性抑制法(ciELISA)在同源包被条件下计算对ABM的抑制比表示。所有抗血清滴度均在1/4000以上,当ABM浓度为50 μg/L时,对ABM-4 - KLH的抑制率为47.5%。值得注意的是,来自BSA免疫原的抗血清具有很低的亲和力,抑制率均在91.1%以上。小鼠单克隆抗体的制备和鉴定。第三次免疫后,经过3次亚克隆共获得21个杂交瘤细胞,其中ABM-4 - KLH诱导的杂交瘤细胞9个,ABM-5 - KLH诱导的杂交瘤细胞12个。通过同源包被抗原筛选小鼠抗血清,ABM-4 – KLH对ABM抑制率为12.5% - 90.1% (ABM浓度为5 μg/L),低于ABM-5 -
KLH中ABM单抗抑制率 <0.1% - 97.1% (ABM浓度为500 μg/L)。总共获得21个针对ABM的单克隆抗体,用于随后的抗体对筛选。夹心免疫分析法中ABM抗体对的筛选。为了建立一种检测ABM的夹心免疫分析法,作者对7种兔多抗和21种小鼠单抗进行了配对检测,共形成294种组合。然后将21个小鼠单抗相互配对,进一步得到441个组合,共得到735个组合。获得的抗体对用夹心法测定,当抗体对测量三次,OD450 nm测定P/ N比大于2.1时,认为夹心免疫分析趋向成功,并确定在此条件下捕获抗体(cAb)和检测抗体(dAb)的浓度为最佳浓度。单抗和多抗对的筛选结果如图2A、B所示,表明所有单抗 - 多抗对的P/N值均小于2.1,未成功形成夹心。单抗和单抗的抗体配对结果如图2C所示,只有两对单抗−单抗的P/N > 2.1,即3A9 (cAb)−2C5 (dAb)和7D11
(cAb)−6G11 (dAb), P/N值分别为3.25和3.91。夹心形成成功率仅为0.27%。图2。建立ABM夹心免疫测定法的抗体组合关系。建立的夹心免疫分析法获得配对抗体OD值(左)和颜色分界P/N值(右)根据(A)小鼠单克隆抗体对为cab,兔多克隆抗体对为dAbs,建立的夹心免疫分析法获得配对抗体OD值(左)和颜色边界P/N值(右);(B)兔多抗对作为cab,小鼠单抗对作为dab;(C)小鼠单克隆抗体对同时为cab和dab。所有实验均为三次重复(n = 3)。
因此,除了精心设计半抗原外,确实有必要尽可能多地生产具有不同识别特性的抗体来建立针对小分子的夹心免疫测定。该结果也提供了实用信息,即建立针对ABM等小分子的夹心免疫分析法具有较高的时间、劳动力和支出成本。此外,不成功的夹心免疫分析形成可能是配对抗体之间的识别位点重叠,这导致了强烈的位阻。用SPR验证夹心免疫分析法检测ABM。以P/N值最高的最佳抗体对7D11 (cAb) - 6G11 (dAb)为基础,通过SPR分析进一步验证抗体-分析物-抗体三元复合物在夹心免疫分析中的特异性结合,如图3 A所示。首先将7D11固定在芯片上,然后加入6G11验证两个单抗之间的结合。如图3A所示,黄色信号维持在基线处,说明7D11与6G11之间没有特异性结合。然后分别在7d11固定芯片中加入20 μM和40 μM的ABM。在步骤 Ⅰ 中观察到绿色和蓝色信号的显著增加,与ABM浓度成正比,表明7D11与ABM成功结合。然后,在步骤 Ⅱ 观察到一定程度的解离,表明7D11−ABM配合物逐渐稳定。在步骤III中加入6G11后,观察到进一步的信号增加,表明形成了稳定的抗体-分析物-抗体三元复合物。图3。(A) SPR验证基于单抗 7D11和单抗 6G11的夹心免疫分析法对ABM的检测效果。ABM浓度为20 μM和40 μM时,7D11−ABM−6G11的SPR分析。步骤1为固定在芯片上的7D11与ABM的结合过程;步骤2为ABM与7D11的解离与稳定过程;步骤III表示6G117D11和ABM结合物的结合过程。(B)基于cAb 7D11和dAb 6G11对的夹心免疫法检测ABM标准曲线(n = 3)。
单克隆抗体在夹心免疫分析中的识别表位分析。为了明确夹心免疫分析中使用的抗体对3A9 (cAb)−2C5 (dAb)和7D11
(cAb)−6G11 (dAb)的识别表位,采用竞争性免疫分析法分别测定单克隆抗体对7种ABM结构类似物(如伊维菌素、多拉菌素、莫西丁素等)的交叉反应性。类似物与ABM之间存在一些结构差异,例如伊维菌素与ABM的唯一区别是C22和C23之间的双键变成了单键,这些结构差异导致了不同的抗体亲和力。通过结构分析,作者推断3A9 (cAb)−2C5 (dAb)在C表位C25处可能有重叠的识别位点,而7D11 (cAb)−6G11 (dAb)在C表位C25处也可能有重叠的识别位点。结合实验数据推断:当抗体同时与ABM结合时,识别位点的重叠可能会造成一定的位阻,从而降低了所建立的夹心免疫分析法的灵敏度。基于分子对接的抗体对分子识别机制研究。为了进一步明确单克隆抗体在夹心免疫分析中对ABM的识别特性,通过抗体同源建模和抗体测序后的分子对接,研究了3A9 (cAb)−2C5 (dAb)和7D11
(cAb)−6G11 (dAb)两对抗体中的4个单克隆抗体对ABM的分子识别机制。结果再次证实了作者的假设,由图4C推断,蓝色的cAb 3A9和红色的dAb 2C5的识别位点分别主要集中在ABM的表位B和表位A上。然而,cAb 3A9和dAb 2C5在ABM表位C上存在一定的空间重叠,如图4C所示,并且在ABM的C12上存在一个紫色的重叠识别位点,这可能导致位阻,不利于夹心免疫分析法的建立。如图4 F所示,由于cAb 7D11与dAb 6G11的识别位点存在一定差异,可以建立基于7D11 (cAb)−6G11 (dAb)的夹心免疫分析法,但由于表位A和C的重叠,导致夹心免疫分析法的灵敏度较低。这些结果进一步证实了建立高灵敏度夹心免疫分析法的关键是获得一对能够识别分析物不同表位的抗体,从而尽可能避免位阻。图4。(A) 单抗 2C5与ABM的分子对接结果;(B) 单抗 3A9和ABM;(D) 单抗 6G11和ABM;(E) 单抗 7D11和ABM。显示了ABM在抗体结合口袋中的位置、与抗体关键氨基酸的相互作用力以及在抗体表面形成的疏水表面。抗体的重链标记为橙色,轻链标记为深蓝色。ABM的表位A为绿色,ABM的表位B为黄色,ABM的表位C为紫色。与ABM相互作用的氨基酸残基被标记。氢键用绿色虚线表示,疏水相互作用用紫色虚线表示。根据分子对接和CR分析结果,推导出(C) 3A9 (cAb)−2C5 (dAb)和(F) 7D11 (cAb)−6G11 (dAb)的识别位点。cAb和dAb的关键识别位点分别用蓝色虚线和红色虚线表示。
一般认为,小分子不能通过夹心免疫分析法检测到,因为它们只有单一的表位,不能同时与两种抗体结合。在本研究中,作者通过精心的半抗原设计、广泛的抗体筛选和抗体配对,证明了夹心免疫分析法可以用于表位距离为6.3 Å的ABM。然而,该夹心免疫分析法的极低成功率和灵敏度表明,夹心免疫分析法的主要性能在很大程度上取决于分析物的结构和抗体识别特性。在夹心免疫分析中,用于小分子的两种抗体的识别位点重叠将不可避免地引起位阻,从而对分析性能产生不利影响。因此,如果可能,作者建议使用目标分析物的单独表位作为半抗原诱导抗体,这样可以避免产生识别位点重叠的抗体,从而减少与目标分析物同时结合时的位阻。抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展,欢迎投稿! Anal. Chem. 2023, 95, 14665−1467