IJBM: 仿贻贝PDA辅助AIE纳米点增强广谱抗菌活性的体外和体内验证

学术 2024-11-18 22:00 北京

【引语】

多数具有优异光动力活性的聚集诱导发光材料（AIEgens）由于与细菌的结合能力较差，仍显示较低的抗菌活性。聚多巴胺（PDA）是一种重要的生物大分子，在包括细菌在内的各种材料表面具有优异的粘附能力。该研究提出了一种新型的仿贻贝PDA辅助AIE纳米点（TPE@PDA Nanodot），具有强大的细菌结合能力和增强的广谱抗菌活性。PDA的优异结合能力使TPE@PDA Nanodot能够有效地粘附在细菌表面。同时，AIE特性赋予TPE@PDA Nanodot监测能力，可以通过简便的荧光成像实时跟踪它们与细菌的相互作用。体外抗菌结果显示TPE@PDA Nanodot对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有优异杀灭效率。此外，在治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的小鼠伤口模型中，使用TPE@PDA治疗的小鼠伤口愈合加速且伤口处载菌量降低。该策略引入了一种简单但有效的设计来增强AIEgens的细菌结合和抗菌能力。

【结果与讨论】

1 TPE@PDA Nanodot 的合成与荧光特性

利用多巴胺在碱性条件下自聚合的特性，简便快速合成TPE@PDA Nanodot。SEM和TEM结果表明材料为不规则的球形，粒径约70 nm，紫外吸收峰的偏移表明PDA的成功包裹。荧光测定结果显示材料具有黄绿色荧光，其Ex=425 nm，Em=530 nm。荧光稳定性测定结果：连续激发1小时，TPE@PDA Nanodot荧光仍维持原有荧光的82%，表明TPE@PDA Nanodot稳定性强。

2 TPE@PDA Nanodot的成像功能

为了探究TPE@PDA Nanodot的细菌成像特性，选取典型的革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌）与革兰阴性菌（大肠杆菌）为研究对象，将两者共孵育后，利用共聚焦荧光显微镜观察成像结果。通过光镜（Bright，只显示细菌）和荧光显微镜（Green-TPE@PDA）观察，可以在荧光通道下清晰看到细菌形貌，证实TPE@PDA Nanodot能够有效的标记大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，对两者进行成像。总体而言，TPE@PDA Nanodot的粘附特性导致其与细菌的紧密结合，从而使TPE@PDA Nanodot可以作为细菌成像研究的有效荧光纳米探针。

3 TPE@PDA Nanodot的抗菌活性

对于大肠杆菌，TPE@PDA Nanodot浓度在0.4 mg/mL时，其杀菌效率达到90%以上，对于金黄色葡萄球菌，TPE@PDA Nanodot的浓度仅为0.1 mg/mL时，其杀菌效率即可达到95%以上。该结果表明TPE@PDA Nanodot对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有抗菌效果，且对于金黄色葡萄球菌的杀菌效果要强于大肠杆菌。进一步探究TPE@PDA对MRSA T144的抗菌效果。在0.2 mg/mL TPE@PDA Nanodot的作用下，随着作用时间的延长，平板上的MRSA T144菌落数减少。作用80 min时，其杀菌效率可达到96%以上。该结果表明TPE@PDA Nanodot不仅对金黄色葡萄球菌具有优异的抗菌效果，对MRSA也有较好的抗菌效果。细菌在TPE@PDA Nanodot处理后使用荧光染料碘化丙啶(PI)对细菌进行染色，进一步证实TPE@PDA Nanodot作用细菌使其失去活性。

4 TPE@PDA Nanodot的抗菌机制研究

为了更深入了解TPE@PDA Nanodot的抗菌机理，利用SEM研究了TPE@PDA Nanodot处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌不同时间前后的形态变化。与对照组相比，用TPE@PDA Nanodot处理60或30分钟后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞表面明显变形且变得粗糙。这些结果表明TPE@PDA Nanodot可以结合到细菌表面并可能破坏大肠杆菌等革兰氏阴性菌的外膜或细胞壁，以及金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖。随着TPE@PDA Nanodot的暴露时间增加到120或60分钟，细菌膜上出现明显的孔隙，导致结构完整性丧失。此外，用TPE@PDA Nanodot处理后，细菌细胞中发生ALP泄漏，也表明TPE@PDA Nanodot可以破坏细菌的结构完整性，导致细胞内成分的释放，从而导致细菌死亡。

在宏观层面上，该研究继续探讨了TPE@PDA Nanodot在破坏生物膜方面的潜在抗菌特性。TPE@PDA Nanodot优异的细菌成像和抗菌性能已得到证实，它们被进一步用作标记和抗菌剂，实时监测生物膜的消除，而无需引入传统的荧光染料。随着暴露于TPE@PDA Nanodot的时间增加，生物膜内的活细菌数量逐渐减少。暴露48小时后，生物膜内仅剩下约50%的初始活菌群。

5 PDA的抗菌增强作用及机制研究

使用常规菌落计数法进一步评估了TPE@PDA Nanodot对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的PDA增强抗菌效果。如图5A所示，与对照组相比，用TPE Nano处理后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落数量略有减少，表明TPE Nano具有一定的抗菌活性。用TPE@PDA Nanodot处理后，菌落明显减少，与TPE Nano相比，TPE@PDA的抗菌活性增强，这归因于PDA的包裹。以大肠杆菌为例，利用扫描电镜进一步探究了PDA的粘附性能。TPE和TPE@PDA Nanodot处理均会导致大肠杆菌的细胞膜变得粗糙。值得注意的是，TPE@PDA Nanodot能有效地粘附在细菌膜表面，而TPE Nano并未表现出这种粘附性（图5C，D）。这归功于PDA中的儿茶酚基团与细菌表面的有机和无机化合物建立了强而可逆的非共价和不可逆的共价相互作用，包括电子引力、氢键和π-π堆积。

6 生物安全性及伤口感染治疗评估

细胞活力实验及体内生物安全性评价表明TPE@PDA Nanodot 在体外和体内均表现出优异的生物相容性和生物安全性，这些结果支持了TPE@PDA在动物模型中治疗应用的潜力。鉴于MRSA带来的严重威胁，该研究建立了小鼠感染MRSA的伤口感染模型，以确认TPE@PDA Nanodot的体内抗菌效力（图6）。与PBS治疗组相比，用TPE@PDA Nanodot和万古霉素治疗的小鼠中观察到的MRSA感染伤口较小（图6D）。第11天，用TPE@PDA Nanodot和万古霉素治疗的伤口完全愈合。该研究进一步分析了治疗后感染部位的细菌载量（图6E）。感染部位的细菌载量在使用TPE@PDA Nanodot和万古霉素治疗后显著减少，相比之下，使用PBS处理的感染部位细菌载量则相对较高。这些结果表明，TPE@PDA Nanodot可以作为减少伤口细菌载量并促进小鼠皮肤MRSA感染模型中伤口愈合的可行替代品。

【结论】

该研究以TPE为核心，PDA为包裹层，开发了一种简便的方法来制备具有优异细菌结合能力和抗菌活性的TPE@PDA Nanodot。得益于其独特的荧光特性，TPE@PDA Nanodot在无需任何清洗过程的条件下可对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌成像。TPE@PDA Nanodot在体外试验中对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌表现出强大的抗菌活性，这归因于TPE@PDA Nanodot增强的细菌结合能力。此外，体内研究结果证实，采用TPE@PDA Nanodot治疗的MRSA感染伤口的愈合速度明显加快。这种增强细菌结合能力的简便方法，加上其有效的抗菌特性，有望催化AIE抗菌剂新型分子设计的开发。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.136762

指导老师：王战辉

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