抗免疫复合物（anti-IC）抗体可用于小分子化合物的非竞争性免疫分析，然而对抗免疫复合物抗体的结构解析少有报道。本研究首次对由Fab220和睾酮（TES）形成的免疫复合物(IC)及其抗IC的FabB12晶体结构进行解析；然后用LightDock以及AlphaFold对三元复合物的结构进行了预测，并用非变性质谱法对这些复合物水溶液中的形成情况进行研究；并将TES替换为其类似物二氢睾酮(DHT)、雄烯二酮(A4)和硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)形成的新三元复合物的结构进行了研究，阐明了该体系的交叉反应机制。本研究为抗IC抗体结合机制提供了基于结构的新见解，或许能指导抗IC免疫分析的开发。![]()
【简介】
在传统的夹心免疫分析方法中，使用捕获抗体（cAb）捕获待测物后利用识别另一表位的检测抗体（dAb）对其进行定量，这种方法在大分子检测中非常有效。但是，当这种方法应用于小分子化合物时，由于小分子的表面积较小，捕获抗体与检测抗体往往难以同时与小分子化合物进行结合。为解决这一问题，可采用一种新策略：先将小分子化合物与抗体结合，形成IC拓展其表面积，然后再用抗IC抗体对其进行检测，即抗IC免疫分析，其已被证明能高度灵敏地检测吗啡、四氢大麻酚、类固醇类激素以及β内酰胺类药物等小分子化合物。然而上述研究缺少对抗IC系统的结构解析。因此，本研究使用X线衍射法解析了抗TES的Fab220片段/抗IC的FabB12片段复合物晶体结构，结合分子建模和AlphaFold预测了三元免疫复合物的可能结构，用非变性质谱法（Native MS）研究了这些复合物在溶液中的形成情况。本研究旨在解析抗IC抗体的结合机制、从结构角度为非竞争性免疫分析方法的开发提供见解。1. Fab220与FabB12的CDR结构解析
制备Fab220与FabB12的晶体，用X线衍射法分别以2 Å和2.7 Å的分辨率结构其解析（图1A、B）并对其CDR的氨基酸序列、North-Dunbrack聚类进行分析，结果见表1。简而言之，Fab220与FabB12的CDR多为典型结构（canonical structures）无显著特点。然后比较了Fab220与FabB12抗原结合腔的结构，发现Fab220的抗原结合腔较小，由较短的CDR H3（9 AAs）和CDR L2、L3构成（图1C）；而FabB12的结合腔较大，其CDR H2、L1、L3形成了陡峭的腔壁，而CDR H3（11 AAs）在腔底形成了一个额外的口袋（图1D）。图1：Fab220与（A、C）FabB12（B、D）的整体结构
表1:Fab220与FabB12的CDR序列与聚类
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2. Fab220-TES复合物的结构解析
制备Fab220-TES复合物的晶体，解析其与TES 的互作位点与识别机制（图2）。发现TES的B-D环被埋在结合口袋内，A环暴露在口袋外；Fab220与TES之间的界面面积为270 Ų，VL和VH的贡献几乎相等（137Ų & 132 Ų），其中CDR H3和L3构成了大部分结合界面，而CDR H2对结合界面基本无贡献；Fab220与TES的相互作用主要是由芳香残基贡献的疏水作用力，此外TES还通过其3=O和17-OH基团与结合位点形成极性相互作用：TES的3=O基团通过水介导的氢键网络与CDR H3主链相连，而17-OH基团在结合口袋底部通过四中心氢键分别与框架区、CDR L3和H3三个残基相连。![]()
图2：Fab220的TES结合位点
3. TES抗体结合位点结构比较
比较了Fab220与此前解析的三株TES抗体（3-C4F5、77Fab、scFv 5F2）的结构与识别机制（图3A、B、C），发现四株抗体都处于疏水口袋中，且TES的D环均处于口袋底部，不同的是Fab220的CDR H3较短，使TES的整个A环暴露在外；结合位点表现出由三或四个芳香残基组成的相似模式；在所有复合物中TES的17-OH在结合口袋底部形成了氢键；在77Fab中观察到其与配体结合后发生了局部构象变化：Y99-H（H3）在结合配体后会向结合位点外偏转。此外还发现Fab220的结合位点在结构上与抗雌二醇（E2）抗体57-2的结合位点相似（图3D），都存在围绕17-OH的四中心氢键网络，因此57-2对TES也有较高的交叉反应性（CR=37%）；而结构差异在于：57-2的结合位点为槽型，仅将类固醇的A、B环边缘暴露在溶剂中，且CDR L2对结合位点形成的贡献较大。
图3:Fab220（A）、77Fab（B）、5F2（C）与57-2（E）与TES形成复合物的结构比较
4. Fab220和FabB12的非变性质谱表征
研究通过非变性质谱表征了Fab220和FabB12片段的质量特性。质谱分析显示了两者的电荷态分布（图4A、B），并且在DTT处理后，轻链和重链分离并显示出相应的质量匹配（图4C、D）。Fab220的轻链与重链质量与理论值高度一致，而FabB12的重链质量则与理论值存在微小偏差，这可能是水或氨基损失所致。
图4: 抗TES Fab220和抗IC FabB12的n-ESI UHMR轨道阱质谱图
A&C为完整条件、B&D为裂解条件。轻链为靛蓝色，重链为绿色
5.雄激素抗IC系统的非变性质谱表征
研究了FabB220和FabB12在有无TES条件下的非变性质谱表现，结果表明无论是游离状态还是抗免疫复合物状态电荷态分布均较窄，说明蛋白复合物构象比较稳定（图5A、B）。没有TES时Fab片段间仅形成少量的二元复合物，加入TES后复合物数量显著增加，然而仅在TES浓度≥2.0 μM时才能检出特异性复合物，表明结合亲和力较低，这限制了该系统的实际应用。其他的雄激素均能与Fab220形成二元复合物，再与FabB12形成三元复合物（图5C-E）。估算出Fab220对雄激素的亲和力顺序为：TES > DHT > A4 ≥ DHEA-S/DHEA。
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图5: 不同配体免疫复合物的n-ESI UHMR轨道阱质谱
6. Fab220复合物与雄激素亲和力的非变性质谱表征
从非变性质谱测量和数据拟合中得出的KD值显示了不同雄激素与Fab片段的结合亲和力（图6&表2）。Fab220对TES的亲和力较高，KD值为16±2 nM；与DHT和A4的KD值稍高，约为19–24 nM；DHEA-S由于样本中部分缺少硫酸基团，难以精确测量其亲和力，推测其KD值为约30 nM，是TES的两倍。亲和力的差异与Fab220结合口袋的结构有关。由于结合口袋不够深，类固醇的A环未与Fab220充分相互作用，限制了Fab220对TES的亲和力和特异性。TES和DHT通过17-OH基团形成了三个氢键因而具有较高的亲和力。而在A4、DHEA和DHEA-S中17-OH被17=O取代，仅能形成两个氢键，因此Fab220与这些配体的亲和力较低。![]()
图6: Fab220复合物与非变性MS的雄激素亲和力测定
表2.类固醇与抗睾酮Fab220片段结合的解离常数和主要结构特征
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7. Fab220-TES-FabB12三元复合物预测结构
使用AlphaFold与LightDock预测了三元复合物的结构，其中LightDock的预测结的非生理性原子异常接近（clash）较少，其预测质量更高。根据预测结果（图7、表3），TES结合界面主要由两个Fab的CDR组成，面积约为1100Ų。该复合物中Fab220-L1和Fab220-L2与FabB12-L3、Fab220-L3与FabB12-L1存在相互作用；Fab220-H1 与 FabB12-H1 和 H3 相互作用；Fab220-H3对结合界面的形成贡献最大，尤其是芳香残基F97-H和Y98-H，直接伸入了FabB12的结合口袋。TES与Fab220强结合（结合面积：170 Ų），也直接与FabB12口袋接触（80 Ų）。TES的A环位于Fab220的H3环和FabB12的W32-L（L1）之间（图7C、D），其O3位置可能与FabB12的H3环的G99-H形成氢键。FabB12的中心结合口袋呈疏水性，并在复合物状态下大部分埋藏在极性溶剂中。总之，三元复合物的形成时两个Fab没有发生重大构象变化，其关键在于Fab220-TES和FabB12之间的高度形状互补性：TES的A环暴露于Fab220结合口袋外因此能与FabB12结合、Fab220的CDR H3能伸入FabB12结合口袋。疏水相互作用在三元复合物的形成中起主要作用。![]()
图7:三元复合物的预测结果，A&C为LightDock结果，B&D为AlphaFold结果【总结】
本研究首次对半抗原结合及相应的抗免疫复合物（anti-IC）Fab抗体的晶体结构进行解析。结果表明：TES与Fab220结合后A环暴露于结合口袋外；Fab220、FabB12与TES等雄激素分子能形成稳定性各异的三元复合物，并解释了交叉反应机制；通过AlphaFold和LightDock预测了完整的三元复合物模型，其中TES暴露的A环被抗-IC抗体FabB12结合、Fab220与FabB12的结构存在较好的互补性、两个Fab的结合口袋都含有疏水性残基从而利于TES和另一个Fab结合，这解释了三元复合物形成的原因。本研究或许能为抗IC免疫分析的开发提供结构见解。【原文出处】
Eronen, V.et al. Structural insights into ternary immunocomplex formation and cross‐reactivity: binding of an anti‐immunocomplex FabB12 to Fab220‐testosterone complex. Febs J. febs.17258 (2024) doi:10.1111/febs.17258.
指导教师：王战辉
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