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【摘要】
软骨藻酸（DA）是一种由有毒海洋藻类产生并积聚在贝类消化腺内的神经毒性化合物，对人类健康造成了潜在威胁。因此，迫切需要开发针对DA的有效检测方法。传统的DA检测方法存在稳定性和灵敏度方面的问题，为了克服这些不足，本研究筛选了可特异性识别DA的高亲和力肽段，开发了一种基于磁珠的直接竞争性酶联免疫吸附测定（dc-ELISA）系统。该方法的检测范围为0.5～10 ng mL−1，检测限为0.29 ng mL−1，相比传统方法灵敏度更高、成本更低，在添加DA的贻贝样品中回收率较高。【引言】
软骨藻酸（DA）由硅藻类浮游生物产生，经食物链主要积聚在贝类的消化腺中，对食用者构成重大健康威胁。食用被DA污染的海鲜可引起呕吐、腹泻、腹痛等症状，甚至会导致失忆性贝类中毒（ASP）和腹泻性海鲜中毒。因此，开发针对DA的有效检测方法至关重要。传统的海洋毒素检测方法存在局限性。小鼠生物检测方法是检测海洋毒素的金标准，但其存在灵敏度低、程序复杂和伦理等问题。其它替代方法，如高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱/质谱法（LC/MS），灵敏度高，但需要大型实验室设备、熟练的操作人员和复杂的校准过程。酶联免疫吸附测定（ELISA）因其快速、高通量和易于使用的优势而备受关注。但ELISA系统中的抗体，特别是酶标抗体，成本高昂且储存条件严格。随着生物受体技术的进步，包括适配体、分子印迹聚合物和多肽在内的各种各样的受体，已经用于传感器构建。多肽具有制备过程简单经济、稳定性优越、不需严格储存条件且易被修饰的特点，是检测海洋毒素（如DA）的最佳受体之一。利用磁珠(MGBs)将多肽整合到ELISA系统中，可以简化样品处理流程，提高检测效率。本研究使用DA-辣根过氧化物酶（HRP）偶联物，建立了一种基于多肽固定化MGB（MGB/肽）的直接竞争酶联免疫吸附测定法。这种基于肽与MGB相结合的策略，极大地提高了ELISA系统的灵敏度、选择性、灵活性，显著降低经济成本，使其能够快速准确地检测海洋毒素。【主要内容】
1.前期工作
1.1 DA特异性亲和肽的制备
采用EDC/NHS法，将DA固定在MGB表面，得到DA-MGBs。以DA-MGBs为靶分子，对噬菌体随机7肽库、12肽库进行四轮生物筛选。对特异性的噬菌体克隆的氨基酸序列进行DNA测序分析。在确定DA特异性噬菌体展示肽后，化学合成制备了用于dc-ELISA框架的DA靶向肽DA-BP1、DA-BP2。1.2 DA-HRP偶联物的合成
用EDC/NHS活化DA的羧基，然后与HRP的胺基反应，合成DA-HRP偶联物，用于基于亲和肽的dc-ELISA系统。在该系统中，DA-HRP和含有DA的样品竞争性地与亲和肽结合，DA浓度与测得的吸光度成反比关系，如图1A所示。将DA-HRP偶联物纯化浓缩，利用MALDI-ToF/MS对HRP和DA-HRP进行质谱分析，同时检测了DA、HRP和DA-HRP偶联物的紫外-可见吸收光谱，结果表明偶联成功（图1B、C）。
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图1.基于亲和肽的dc-ELISA系统的建立
1.3 DA特异性肽的选择
将合成的肽段用于dc-ELISA检测DA。首先优化DA-HRP的浓度，当DA-HRP稀释250倍时为最佳稀释浓度。随后，比较合成肽的结合亲和力，发现DA-BP1比DA-BP2对DA的结合亲和力更高（图1D）。在0～75 ng mL−1的DA浓度范围内观察到线性相关，LOD为10.94 ng mL−1（图1E）。然而，这一结果并不能证明所开发的dc-ELISA优于传统的基于抗体的ELISA系统。因此，利用MGB作为亲和肽受体的载体，将其应用于dc-ELISA中，以提高其传感性能。1.4 MGB/肽偶联物的制备
以戊二醛为交联剂，将链霉亲和素（SA）与MGBs共价结合得到MGB/SA复合物，有效地使MGBs功能化以进行后续的生物特异性相互作用。随后，通过生物素-亲和素相互作用将生物素化的DA特异性肽DA-BP1固定在MGB/SA复合物上，得到MGB/肽偶联物并充分表征。2. 基于MGB/肽的dc-ELISA的建立及评价
2.1 参数优化
为了提高基于MGB/肽的dc-ELISA的传感性能，进行了相关参数的优化。最终确定最佳条件为10 ug mL - 1 DA-BP1，106 MGBs，250倍DA-HRP稀释度。2.2 选择性及交叉反应性试验
检测分析的选择性和交叉反应性是至关重要的。利用基于MGB/肽的dc-ELISA评估DA-BP1对靶分子的特异性。发现DA-BP1对DA亲和力最高，其次是其结构类似物KA，对OA、DTX-1、DTX-3、STX、dcSTX和TTX等几种海洋毒素的亲和力显著降低（图2A）。原因可能是DA和KA具有共同的结构框架，但二者在侧链和官能团上的细微差异导致DA-BP1对DA具有更高的亲和力，而其它海洋毒素与DA结构框架不同。使用含有DA和其他等量毒素的样品混合物检验了所建立方法的交叉反应性（图2B）。结果表明，该系统与某些海洋毒素具有交叉反应性，但对DA具有显著的特异性。DA-BP1优先与DA而不是其他毒素发生反应，从而能够在毒素混合物中准确识别DA。此外，考虑到真实样品中DA的浓度通常远高于其他毒素的浓度，而在交叉反应试验中使用的毒素浓度相同，可以认为该方法可以有效地作为鉴定真实样品中DA的替代方法。由于短肽体积小，与蛋白质相比具有更灵活的结构，其与小分子结合后可导致结构变化。图2C显示了DA-BP1在包括DA在内的各种毒素存在下的圆二色（CD）光谱。DA-BP1与DA结合后，在190～200 nm波长范围内，光谱发生了细微的变化，说明DA-BP1在与DA相互作用时发生了构象变化。而DA-BP1与其他对照毒素孵育时，没有观察到类似的结构变化。随后进行了分子对接模拟来观察DA-BP1的结合位点。结果表明，DA-BP1的羟基和羧基可以与DA的三个羧基形成氢键，在结合相互作用中起重要作用（图3）。![]()
图2.DA-BP1对各海洋毒素的特异性、交叉反应性及CD谱图![]()
图3.利用DockThor web服务器对DA-BP1与DA之间的氢键进行分子对接模拟
2.3 检测性能评价
对建立的基于MGB/肽的dc-ELISA的检测性能进行评价，并与传统的dc-ELISA进行比较。在此分析中，将DA-HRP和不同浓度的DA依次添加到MGB/肽中。DA和DA-HRP的存在启动了与MGB/肽的竞争性结合，导致IR（%）随DA浓度的增加而增加。图4A为建立的基于MGB/肽的dc-ELISA在DA浓度范围内的饱和曲线。如图4B所示，本研究开发的传感系统的LOD为0.29 ng mL−1，灵敏度比传统的基于肽的dc-ELISA高37倍，表明由于在ELISA中加入了MGB/肽，传感器性能得到了显著提高。将开发的ELISA与商用ELISA试剂盒的性能进行了比较，两种ELISA系统的标准曲线具有可比性，但商业试剂盒的LOD保持在0.17 ng mL−1（图4C）。此外，还进行了稳定性评价。将MGB/肽保存在4℃条件下，连续30天监测其检测性能。结果表明，DA检测性能在15天后才开始下降（图4D）。同时，开发的dc-ELISA对独立的8个孔的吸光度差异可以忽略不计，重复性好（图4E）。![]()
图4.基于MGB/肽的dc-ELISA系统的性能研究
2.4 在实际样品中的可行性
为了验证其在实际样品中检测DA的可行性，将该系统用于分析添加不同DA浓度的贻贝组织。表1显示了每种样品的回收率结果。结果表明，回收率为94.02%～104.61%，相对标准偏差(RSD)<9%。此外还与商用ELISA试剂盒进行了比较，结果表明两种方法之间具有良好的一致性（图4F）。表1.本研究开发的ELISA系统和市售ELISA试剂盒对加标贝类组织中DA的检测结果
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【结论】
本研究成功筛选出了DA的特异性识别多肽，建立了一个基于MGB/肽的dc-ELISA检测系统，用于贝类样品中DA的灵敏检测。与其他已报道的方法相比，该系统检测微量DA的灵敏度明显更高，在实际贝类样品中检测DA的回收率高，RSD低。这表明本研究建立的DA检测系统是一个高效的、有前景的海洋毒素检测和食品安全保障平台。【原文出处】
Kim JH, Cho CH, Park TJ, et al. Rapid and sensitive detection of domoic acid in shellfish using a magnetic bead-based competitive ELISA with a high-affinity peptide as a molecular binder [J]. Chemosphere,2024.
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2024.143274
指导教师：王战辉
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