[前言]
霉菌毒素是由污染谷物、坚果和水果的多种真菌产生的有毒次级代谢产物。食品和饲料中存在这些毒素给农业、食品行业造成重大经济损失。因此，监测整个食品链中霉菌毒素是全球食品安全部门的首要任务之一。有效的分析方法是监管机构确保高标准食品和饲料安全的重要工具。基于抗体的免疫分析在农业食品行业被广泛用于分析受管制的霉菌毒素。因此，许多免疫分析企业都在销售针对这些化合物的快速检测方法。唯一例外是展青霉素，这是一种主要由扩展青霉菌产生的霉菌毒素。
已报道的展青霉素特异性和高亲和力抗体制备基本都以失败告终。最近研究表明其主要挑战在于展青霉素分子的高亲电反应性。在本研究中, 展青霉素与含硫醇芳香族化合物反应形成加合物。针对这些加合物制备抗体，则可能通过简单的衍生化反应分析受展青霉素污染的样品，这种策略以前用于分析草甘膦和丙烯酰胺等，但由于获得的抗体对这些衍生物的亲和力有限。这种限制可以归因于两个主要因素: (i)诱导抗体的半抗原柔性高; (ii)衍生化反应中其他副产物的形成。而本文提出的策略则能很好地克服这两大因素。
[研究内容]
1.展青霉素衍生化
研究人员假设，通过使用苯二硫醇钠代替芳基单硫代醇钠可改变芳基硫醇与展青霉素的加成反应的机理途径，并可能形成更稳定的独特加合物。在将第一个硫醇基团加成到展青霉素的亲电C-7位后，有利于分子内硫代-迈克尔加成。该反应可以产生足够稳定的化合物6，成为主要产物(Scheme 1，路线 b)。
Scheme 1. 硫醇对展青霉素加合的拟议途径
为验证假设，首先将展青霉素与市售的苯二硫醇钠进行反应。反应在室温下在100mM磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中进行。混合所有反应物后，立即观察到深黄色，表明展青霉素与二硫醇发生了反应。几分钟后(文章实验流程中注明为20分钟)，进行酸性处理。中间体 5 的 γ-内酯部分会开环形成加合物I (Scheme 2)。
Scheme 2.展青霉素单二硫醇加合物(I-IV)的形成
展青霉素与其他苯二硫醇钠的反应类似，主要生成相应的单二硫醇加合物(Scheme 2)。当苯二硫醇钠在硫醇基团的间位/对位上具有给电子基时，效率非常高(如7b、7c分别形成加合物II和III)。相反，使用含吸电子氰基(7d,此时亲核性降低)形成加合物IV的效率非常低。
由于这些加合物在水介质中稳定，使用过量的7或延长反应时间可确保反应并确保体系干净。展青霉素加合物可有效与蛋白质结合并引发有效的免疫反应。
2.免疫原制备与动物免疫
首先利用加合物I的羧基通过碳二亚胺法与载体蛋白BSA和OVA偶联。MALDI-TOF鉴定二者的偶联密度分别为6.0和4.5。为评估BSA-加合物缀合物的免疫原性，对兔子免疫，并通过icELISA测试了抗血清。不幸的是，获得的抗体滴度较低，并且观察到对游离加合物 I 的识别较差。这个结果虽然可以归因于免疫原中相对较低的半抗原负载和加合物中存在醛基，该醛基可以在免疫后在体内被蛋白质氨基进行修饰。为了解决这个问题，研究人员决定使用该醛基接入连接臂。
因此研究人员设计了两种加合物I的衍生物用于免疫，即半抗原Ia和Ib(Scheme 3)。其中，Ia连接臂为短链羧基，Ib连接臂为长链叠氮(使用点击化学CuAAC偶联蛋白)。
Scheme 3.半抗原Ia、Ib的制备
Scheme 4.半抗原Ia、Ib偶联物的制备
为制备半抗原Ia缀合物(Scheme 4)，半抗原Ia使用3当量的EDC-NHS在＜-25℃下(低温防止复杂的副反应)时形成双NHS酯。研究人员假设双NHS酯中连接臂段羧基会优先结合(文章中并未给出证实)。MALDI-TOF鉴定BSA-Ia、OVA-Ia、HRP-Ia的半抗原密度分别为13.7、4.6、和0.9。
为制备半抗原Ib缀合物(Scheme 4)，研究人员首先用炔丙基对蛋白质进行功能化，其摩尔比应足以满足预期作用的赖氨酸残基: BSA为24.8，OVA为3.5，HRP为1.3。半抗原 Ib 与炔烃修饰蛋白质之间通过点击化学偶联，反应在氮气下进行。反应中每个炔基对应2-4个半抗原当量。缀合物通过尺寸排阻色谱法纯化。MALDI-TOF鉴定缀合物BSA-Ib、OVA-Ib和HRP-Ib的半抗原密度为15.9、2.3 和 0.4。
研究人员首先通过使用BSA-Ia和BSA-Ib进行免疫来评估兔子的免疫反应。通过icELISA 评估获得的两种抗血清时，观察到在低纳摩尔范围(4.6-10.6 nM)内具有出色IC50值。
3.单抗制备与分析方法构建
研究人员采用标准杂交瘤技术，获得BSA-Ia的小鼠杂交瘤细胞，产生了三个能够识别加合物I抗体的杂交瘤。在亲和纯化后，使用ELISA鉴定mAb。这三种抗体成功识别了两种包被结合物(OVA-Ia和OVA-Ib)，展青霉素的IC50值低于7.0 nM。这种形式中最敏感的免疫试剂对是mAb #116与异源缀合物OVA- Ib的组合(IC50=2.9nM)。在直接竞争形式中，当与同源酶示踪剂HRP-Ia一起使用时，发现mAb #13和#17的IC50值甚至更好(IC50=0.7-0.8nM)。值得注意的是，当使用加合物 I 或展青霉素(与7a反应后)作为竞争物时，这些抗体的抑制曲线重叠，而单独测试时它们无法识别7a或展青霉素，也无法识别其他霉菌毒素。
研究人员还测试了它们在免疫层析试纸条中的性能。使用BSA-Ia作为测试线，测试线上的衰减信号表明样品对分析物的存在呈阳性。初步实验表明，使用mAb#17后，线条更亮、更清晰，因此进一步的工作利用了这种抗体。
展青霉素标准溶液通过在测定缓冲液中进行连续稀释来制备，并将2% (v/v)的1mg/mL 苯二硫醇钠(7a)钠盐水溶液添加到每个校准器中。在室温下孵育 30 分钟后，用免疫试纸条分析样品，并在半对数图上绘制10分钟后测试线和控制线(TL/CL)信号比与棒曲霉素浓度的关系。如Figure 1所示，该检测的抑制曲线显示出出色的IC50值(0.2 ng/mL)，定量限(LOQ)约为0.03ng/mL，远低于食品中展青霉素的最大允许浓度。
Figure 1.基于抗体#17和偶联物BSA-Ia的免疫层析分析的代表性抑制曲线.(黑色曲线: 展青霉素标准品溶于缓冲液; 红色曲线:展青霉素标准品溶于1/10缓冲液稀释的苹果汁; 绿色曲线: 展青霉素标准品溶于1/50缓冲液稀释的苹果汁.)
于苹果汁中检测，通过在检测缓冲液中以1/10和1/50(v/v)稀释的果汁，制备展青霉素标准溶液，来评估基质效应。稀释和衍生化后，通过前面描述的免疫色谱法分析校准物。从稀释苹果汁中获得的抑制曲线与缓冲液中的曲线紧密重叠(Figure 1)，表明样品在简单稀释后即可进行分析。为了验证这一说法，用研制的免疫试纸分析了四种天然被展青霉素污染的苹果汁(商用质控参考材料)。在分析缓冲液中稀释1/10和1/50，然后添加衍生化试剂。免疫试纸测定的展青霉素浓度与供应商报告的所有四个样品的值一致。值得注意的是，该检测系统还可以轻松地目视识别受监管水平的污染样品(Figure 2)。
Figure 2. 分析受展青霉素污染的苹果汁样本后扫描免疫条纹的图片. 空白样品(自制健康苹果汁)和质量控制参考物质在分析前分别在测定缓冲液中稀释1/10和1/50.
[小结]
研究人员所提出的方法利用了展青霉素高亲电反应性以及与苯二硫醇钠之间显著的反应。该反应在室温下的水介质中非常快速且定量地进行，以干净的方式产生单一化合物。所得加合物稳定且结构复杂，足以诱导强烈的免疫反应和抗体形成。最终产生了三种对展青霉素加合物具有亚纳摩尔亲和力的单克隆抗体，其中一种抗体被成功整合到原型免疫色谱测定中，用于快速测定苹果汁样品中的展青霉素。
[原文出处]
Duncan H, Agulló C, Mercader J V, et al. Harnessing the Intrinsic Chemical Reactivity of the Mycotoxin Patulin for Immunosensing[J]. Analytical chemistry, 2024, 96(30): 12370-12377.
https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c01631
指导老师：王战辉
