即食沙拉是指已经清洗好并封装在密封袋内的蔬菜，消费者无需再做任何处理即可直接食用。随着这种产品市场的快速增长，确保其微生物质量成为了至关重要的任务。微生物污染可能发生在沙拉生产的各个环节，包括种植、洗涤、包装、储存、运输和分销，以及任何可能选择或促进微生物生长的操作。这些微生物不仅会导致产品质量下降，还可能对人类健康造成危害。为了有效监控这些污染物，本文综述了与即食沙拉中微生物污染相关的研究，旨在强调即食沙拉生产过程中关键的微生物污染环节，探讨用于监测即食沙拉微生物质量和安全性的解决方案。关键词：沙拉，污染，病原体，保质期，NGS
研究背景
即食沙拉通常指那些经过清洗并包装好的蔬菜叶子，可以立即食用而无需再次处理。随着健康意识的提升和生活节奏的加快，这类产品受到了消费者的广泛欢迎。然而，即食沙拉产品正面临着微生物安全性的挑战，它们在进入市场前未经杀菌处理，从种植、收割、清洗、包装、存储、运输到分销的每一个环节都可能成为微生物污染的源头，包括细菌、真菌以及其他病原体，这些微生物可能会引起食品的腐败甚至是食源性疾病。目前有关食源性疾病的报道、产品召回以及调查结果显示，食叶类蔬菜中存在食源性病原体，但这些病原体通常在样本中的检出率不高，并且检测难度较大。本文强调了整个即食沙拉产品供应链中控制微生物风险的重要性，并指出——尽管零风险的目标难以实现，但可以通过采用新的可持续技术来支持在产品到达消费者之前的管理决策，以降低微生物风险。The aims of this review work：
（1）强调即食沙拉生产过程中各种微生物(细菌和真菌)污染来源的关键点；
（2）检查现有方法并概述监测即食沙拉微生物质量的途径。
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图1即食沙拉生产链，以及各阶段的微生物污染风险。
即食绿叶蔬菜（RTELG）从农场到餐桌过程中的微生物风险
即食食品是指由生产商/制造商为直接消费而设计的产品，无需通过烹饪或其他处理来消除或减少微生物至可接受水平。即食绿叶蔬菜通常分为三种：混合沙拉、切件蔬菜和蔬菜托盘。在当前的即食绿叶蔬菜行业中，任何新技术都面临着两大挑战：一是实现对生产过程中诸多变量的完全掌控；二是确保这些技术的应用能够对食品特性产生积极或至少是中性的影响。根据美国食品和药物管理局（FDA，2009）的《食品法典》，即食绿叶蔬菜被归类为潜在的高风险食品，其在1998年至2008年间多次导致食源性疾病的发生。在即食绿叶蔬菜生产中，从种植、收割、清洗、包装到储存和运输等各个阶段（图3）均存在微生物污染的风险，污染源可能来自温度管理（运输、加工、储存期间）、水源质量、设备的设计与卫生状态以及工人的个人卫生和培训等方面。此外，袋装沙拉的特殊工艺可能引入不寻常病原体，真菌和细菌可作为寄生菌和腐生菌进入袋中，许多物种表现出内生菌特性（图2）。![]()
图2.袋装沙拉的微生物检测。A) 袋装火箭叶样品；B) 菘菜；C) 商业袋装沙拉的微生物测试：塑料袋外部用酒精消毒后，在无菌柜下打开，进行叶子亚采样以培养真菌和细菌；D) 琼脂培养基用于选择真菌和细菌；E、F、G)叶子直接放置于琼脂表面，以计数或分离附生污染物和病原体的菌落形成单位，经过氯化溶液洗涤后，叶片切碎并接种于琼脂中以分离内生微生物；H) 从商业袋装沙拉中提取的火箭叶中生长的污染物；I) 从火箭叶中分离的内生菌，接种片段发育出深色真菌。
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图3. RTELG加工厂的一些阶段。A)原材料的接收和冷藏室(4°C)的储存;B)切割合适的浆料;C)手动选择;D)洗涤、消毒，这里显示的是通过洒洗预洗，然后进行两次浴缸洗涤(5-8°C);E)烘干，转鼓式烘干机(右)，振动带式输送机(左)用空气吸入系统完成，这一步之后是离心机或冷热隧道系统进一步烘干，具体取决于蔬菜类型;F)包装的产品选择(光学系统);G)垂直自动分形包装;H)袋装沙拉的自动称重(左图)和气体控制(右图);I)符合欧盟和意大利法律的标签示例;J)纸板箱储存(4°C)。(图片来源:D.Giannino)。
食品安全法规对即食食品中允许的微生物种类和限量有严格规定。欧盟委员会法令要求即食食品生产商遵守基于危害分析和关键控制点(HACCP)原则的产品安全管理体系，该体系确定了沿生产过程的关键控制点，其中包括原材料接收、选择（手动清洁和切割）、消毒（清洗和干燥）、包装（袋装、盒装、包裹等）以及分销（本地储存、运往市场）等步骤。其强调的控制要点有：l温度控制：在整个生产链中，低温阈值是强制性的，旨在抑制病原体的生长速度。但是，单靠温度控制不足以完全防止疾病的发生。
l水质管理：在清洗过程中，水和产品容易受到粪便或肠道病原体的污染及交叉污染，因此必须严格维护水质。
l消毒剂使用：氯是最常用的水消毒剂，它有助于减少交叉污染，在水处理过程中发挥着重要作用。
l设备卫生：切割机、工具、包装薄膜和传送带都是潜在的污染源和交叉污染媒介，需要保持清洁卫生。
l包装技术：抗菌包装技术正在研发之中，重点在于抗菌小袋、新型膜材料以及抗菌涂层，特别是天然化合物如精油的应用。
l标签信息：标签应当清楚地标明产品的成分、营养价值及其来源，以保障消费者的知情权。
真菌和细菌的生物多样性及其在自然或人工环境中的群落结构是众多研究的主题。近几十年来，新技术的发展加速了基于DNA和RNA的生物多样性研究，克服了农业系统中大多数细菌和真菌物种不可培养性的限制。随着公共数据库的建立，我们对微生物如何在食物中定殖和传播，以及它们对人类健康的影响有了更深入的理解。尽管如此，即食沙拉的微生物污染风险仍然较高，尤其是全球缺乏一致、可重复的微生物污染监测方案，导致各地区的检测结果难以比较，因此，探讨如何高效监测即食沙拉微生物质量成为降低其微生物风险的重要手段。应用于即食蔬菜检测的微生物方法
基于ISO标准的多种微生物检测方法已广泛应用于食品病原微生物的检测。这些方法通常依赖于琼脂培养基中的富集培养和菌落分离。目前，食品中微生物污染的鉴定主要基于传统的微生物表型分析。通过观察分离出的菌落的形态特征（如颜色、色素积累、特定培养基上的反向生长）和显微结构，结合一系列生化反应测试，进行初步鉴定。为进一步确认微生物，常采用分子生物学技术，尤其是PCR检测法。然而，由于即食蔬菜（RTE蔬菜）中微生物分布往往不均匀，合理的抽样策略至关重要，以确保检测结果的代表性。此外，ISO标准为食品样品的微生物检测提供了详细指导，明确了检测方法和步骤，建立了定量分析样品微生物的程序，确保了检测过程的科学性和一致性。应用于即食蔬菜检测的分子生物学方法
分子检测技术已广泛应用于食品安全监测，尤其是环介导等温扩增技术（LAMP），被视为传统培养方法的有效替代。但分子检测方法的灵敏度还存有争议，部分观点认为其不如传统方法灵敏。然而最新研究表明，LAMP的检测限（LoD）为1.3-28 CFU/反应，而实时PCR的LoD为100 CFU/反应，这显示出了LAMP在灵敏度上的显著优势。在即食绿叶蔬菜的病原体检测中，直接使用qPCR技术仍面临挑战，主要由于检测样品中病原体浓度较低，使其DNA含量低于qPCR的灵敏度阈值。然而，qPCR在富集培养后，对病原体的筛选表现出较高的可靠性。同时，高通量测序等新兴技术展现出巨大的应用潜力，不仅能够全面分析即食食品中的微生物群落，还可实现病原体的精准鉴定，为食品安全监测提供新的解决方案。1. 基于PCR的分子检测技术
PCR检测技术为食品微生物监测提供了快速而精确的工具，实时PCR（qPCR）是最常用的快速检测方法之一，但蔬菜中的抑制性化合物可能影响扩增效率。因此，通常需要在PCR扩增前对样品进行预处理，以浓缩目标微生物并减少抑制剂的干扰。通过富集步骤提高qPCR的灵敏度，部分研究者也尝试直接从蔬菜中提取DNA用于qPCR检测。富集方法方面，大肠杆菌，通常使用鲜绿色胆汁乳糖汤或改良的胰蛋白酶豆汤（mTSB）；沙门氏菌，常用缓冲蛋白胨水、RV肉汤、TTB和SLB肉汤进行富集。富集步骤也用于厌氧病原体的检测，如艰难梭菌和空肠弯曲杆菌。针对艰难梭菌的检测，先对几种蔬菜样品进行预富集，在含有0.1%牛磺胆酸的色氨酸-蛋白胨-葡萄糖-酵母提取物（TPGY）肉汤中培养2至4天，随后转移至含盐酸半胱氨酸、莫西沙星和诺氟沙星的选择性培养基中进一步富集。检测空肠弯曲杆菌时，通常将新鲜蔬菜样品在37°C的波尔顿肉汤中预富集4小时，再在42°C下继续富集44小时。最后从2mL的富集肉汤中提取DNA，并采用qPCR或ddPCR检测靶向hipO基因。研究表明这两种PCR方法在灵敏度上均高于传统方法。尽管富集步骤能够显著提高qPCR的灵敏度，但一些研究者致力于减少或避免此步骤，直接从蔬菜样品中提取DNA进行目标微生物检测。例如，开发一种优化的样品处理方法，去除植物中影响qPCR的抑制性化合物，或尝试使用从磷酸盐匀浆样品中提取DNA，再通过特异性qPCR检测叶菜中的多种病原体。此外，一些浓缩技术也已被应用，包括两步离心法处理食物悬浊液，随后对所得的重悬微球进行DNA提取。两步法将PCR检测限从106 CFU/g(未处理样品)提高到103 CFU/g，提高了将1000倍。活力PCR（vPCR）作为PCR技术的进化版，是目前唯一能够专门扩增活细胞DNA的PCR方法。传统PCR和qPCR中常使用的活性染料包括单叠氮丙啶（PMA）和单叠氮乙啶（EMA），这些染料作为核酸插层剂，无法穿透完整的细胞膜，仅对死亡细胞起作用。当暴露于可见光时，染料通过共价键与死亡细胞的DNA结合，从而抑制其后续的扩增。现在PMA已被成功用于活的沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的定量检测。然而，vPCR的结果容易受到PCR抑制剂、细胞裂解以及有机化合物的干扰，可能导致聚合酶活性不稳定，从而影响检测的准确性。针对即食沙拉微生物检测的替代方法之一是利用单链DNA或RNA适体，这些适体能够与特定的非核酸分子结合。该技术称为“指数富集配体系统进化”（SELEX），包括寡核苷酸文库的孵育、分离、PCR扩增和纯化等步骤。适体技术具有成本低、可扩展性强的优点，能够实现多种目标分子的实时检测，不仅缩短了检测时间，还缩小了实验室检测与现场检测之间的差距。此外，横向层析试纸条技术虽然广泛应用于病原体检测，但由于灵敏度较低，难以准确检测袋装沙拉中低浓度的病原体。2. 新一代测序(NGS)方法
NGS技术鉴定微生物群落可以同时检测可培养和不可培养的病原体，这一技术在食品安全领域展现出巨大的应用潜力，其成本也在逐步降低。16S rRNA测序具有广泛的应用前景，但在物种水平上的分类准确性较低。为解决这一局限，宏基因组学（对所有提取的DNA进行全面测序，无需PCR扩增特定区域）和元转录组学（对cDNA进行测序，通过提取总RNA并逆转录，仅针对活性微生物群落进行分析）越来越受到青睐。这些技术能够直接测序目标核酸，提供更全面的微生物信息。早期研究显示，NGS在微生物检测方面优于传统培养方法。Illumina®测序平台常用于即食沙拉微生物群的研究，通过16S rRNA测序方法评估微生物群落的分布。目前可用的第三代测序技术克服了Illumina®平台的一些局限性，能够实时测序更长的DNA片段，理论上可以在物种水平上识别细菌和真菌病原体。这些技术由两大领先的商业平台提供：太平洋生物科学公司（PacBio）的单分子实时（SMRT）测序和牛津纳米孔技术公司（ONT）的纳米孔测序。两者均已用于即食沙拉中的微生物群分析。PacBio平台能够测序长达约2500bp的片段，包括细菌的16S-ITS-23S rRNA区域。该技术已被用于研究水培和水耕系统中生产的各种蔬菜的细菌群落。而ONT测序则具有简单快速的文库构建过程（仅需数小时），无需扩增即可快速处理样品。这些特性使其在微生物检测中的应用更为便捷高效。即食沙拉的质量评估
即食沙拉的外观、质地、成分和气味变化等，常被用作评估微生物增殖和产品卫生完整性的指标，通过监测这些指标，可以有效预测产品的保质期。在即食沙拉保质期内的质量评估中，常用的实验方法可分为破坏性和非破坏性两类。破坏性方法用于定量评估包装叶片中的营养物质和生物活性化合物的保留情况，及衰老过程的检测。评估的质量参数包括光合色素含量、总多酚和抗氧化能力、总糖和维生素C含量，以及叶片的电解质泄漏率。此类生化分析通常在专门实验室进行，基于具有代表性的样品批次来评估叶类蔬菜的生理状态和营养特性，这些数据对于优化生产和储存条件，提升产品质量并延长保质期至关重要。非破坏性方法依赖于快速分析技术，几乎无需复杂的样品准备。随着大规模、客观评估食品安全和质量的需求不断增长，这类方法在包装厂、供应链和零售环节中越来越受重视。色度分析、荧光法、反射光谱、图像分析以及高光谱成像技术已被广泛应用于质量评估中。然而，受品种、季节、采后处理和储存条件的影响，识别可作为质量标志的挥发性有机化合物仍然是一项挑战。振动光谱与高光谱/多光谱成像技术已成功应用于农田中，实现对某些作物植物病原体攻击的早期检测。在即食沙拉生产的各个阶段，红外或紫外-可见-近红外传感器作为非侵入性工具，有效支持了产品在装袋前后的质量监控。然而，这些技术仍需针对特定类型的蔬菜进行进一步研究，并需对特定微生物的存在、活性、丰度和危害性进行更精确的校准，以提升检测的准确性和可靠性。结论
尽管即食沙拉的微生物风险不可能完全消除，但通过采用新兴的技术手段，可以有效减轻这一风险。污染可能发生在生产链的各个环节，尤其是种植和收获阶段。因此，行业利益相关者应意识到，仅靠现有的预防措施不足以完全控制微生物污染，而是需要结合多种创新手段来管理风险。纳米孔技术 (ONT) 等基于高通量测序的方案，能够通过实时监测生产链中的关键节点，帮助进行早期的微生物污染检测。这些技术的相对低成本和高灵敏度使其成为未来即食食品微生物安全监控的理想选择。此外，结合生物信息学分析和多变量预测模型，可以更加精准地评估微生物风险，并为未来的食品安全决策提供数据支持。为了确保即食沙拉产品的高质量和安全性，未来研究应继续专注于开发高效、低成本的检测技术，并完善微生物污染监测方案。此外，全球食品安全监管应推动统一的微生物标准和检测方法，以便在不同地区间共享和比较数据。原文出处：
Nikola Klištincová, Lorenzo Pin, Andrea Puškárová, Donato Giannino, Mária Bučková, Maya D. Lambreva, Andrea Manfredini, Loredana Canfora, Domenico Pangallo, Flavia Pinzari.From farm to fork: fungal and bacterial contaminants and their diagnostics in the production steps of ready-to-eat salads.Trends in Food Science and Technology.
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.tifs.2024.104573
指导教师：王战辉 教授
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