Walker:亲和力成熟使抗体的特异性增强且维持构象稳定性

学术   2024-11-06 17:53   北京  



题目应修改为“破坏构象稳定”非“维持”

近年来,单抗已成为最有前途的治疗药物之一。B细胞来源的单抗作为治疗剂的一个潜在优势是受到了体内选择机制的影响,具有良好生物物理特性。本研究分析了来源于不同B细胞亚群的人抗体的生物物理性质,发现体细胞超突变与抗体特异性正相关构象稳定性相关。本研究使用高通量筛选测定评估了400单克隆抗体mAb的多反应性,疏水性和热稳定性。结果表明与幼稚B细胞相比记忆B细胞和长寿浆细胞(LLPC)的mAb显示出降低的多反应性、疏水性和热稳定性水平。体细胞超突变(SHM)与所有三种生物物理特性以及BCR表达水平呈负相关。此外,人B细胞来源的mAb的可开发性特征与临床mAb相当,表明其具有较高的治疗潜力。本研究为亲和力成熟对抗体生物物理特性影响提供了新的见解有助于治疗性抗体开发。

【引语】

mAb一类重要的生物治疗药物,截至2019年初,已有70多种mAb被批准用于治疗市场上的大多数治疗性mAb源于免疫小鼠或噬菌体展示,但近期研究表明,靶向治疗相关自身抗原的mAb也可以从某些患者群体中回收。优秀的治疗性mAb应兼具良好的结合能力以及“药物样”生物物理性质,如低聚集倾向、高稳定性和溶解性、低脱靶反应性和低粘度上述特征统称为“可开发性”。已经多种早期筛选试验可用于识别具有良好可开发性的先导分子降低下游开发风险测定mAb自结合或与柱基质结合的倾向测量抗体自身互作聚集导致的溶解性降低与高粘性测定抗体多反应性的多抗原组酶联免疫吸附ELISA方法测定抗体疏水性的疏水互作色谱HIC

B细胞经历了体内耐受机制的选择,因此人B细胞衍生的mAb具有较低的免疫原性、多反应性和脱靶反应性然而体内选择过程是否如何影响特异性以外的生物物理特性如稳定性、聚集倾向、表达滴度和疏水性,以及这些特性在来自不同B细胞亚群的mAb的差异亦不明确
本研究分析了共400株来自于幼稚B细胞IgMIgG 记忆B细胞LLPCmAb测定了这些抗体的多反应性疏水性与热稳定性结果表明,与幼稚B细胞衍生的抗体相比,记忆B细胞和LLPCs编码的抗体具有较低的多反应性和疏水性,但稳定性也显著降低。SHM与所有这三种特性以及B细胞受体(BCR)表达水平呈负相关,表明亲和力成熟的过程导致抗体特异性增加,构象稳定性降低此外,绝大多数B细胞来源的mAb表现出与临床mAb相似的热稳定性、多反应性和疏水性,这表明大多数B细胞来源的单克隆抗体具有“药物样”生物物理特性。本研究治疗性抗体亲和力、特异性和稳定性之间的权衡提供了见解。

【内容介绍】

1mAb的分离

荧光激活细胞分选术FACS,从LLPCIgGIgM记忆B细胞以及幼稚B细胞中克隆并表达了400个单克隆抗体。LLPC(CD19-CD38+CD138+)从来自四个健康供体(HDs)的骨髓单核细胞样本中分选,而幼稚(IgM+CD2CD10-)和记忆b细胞(IgM+CD27+IgG+CD27+)从来自三个HDs的外周血单核细胞(PBMC)样本中分选(S1A)。通过单细胞PCR扩增抗体重链和轻链可变区(VHVL ),随后克隆并在酿酒酵母工程菌株中表达为全长IgG1来源于不同B细胞亚群克隆的单克隆抗体显示了符合预期的SHM水平LLPCs > IgG+记忆B细胞> IgM+记忆B细胞>幼稚B细胞(S1B)

 


S1.FACS分选结果与SHM水平

(A)用于从LLPCs中分离mAb的代表性分选门Gates。来自4HDs的骨髓单核细胞在分选前被混合用于从幼稚B细胞、IgM+记忆B细胞和IgG+记忆B细胞中分离单克隆抗体的分选门。PBMCs分类前3HDs中收集。红色门表示单细胞分选的B细胞群。()(B体细胞突变水平

2多反应性评价方法的确定

多反应性单克隆抗体从循环中清除的速度比单特异性单克隆抗体快得多故本研究使用一种可以预测体内快速非靶介导抗体清除的分析来评估B细胞来源的mAbs的多反应性。为了评估不同检测形式中人血清半衰期和多反应性之间的关系,使用16株在I期临床试验中获得的药代动力学数据mAb进行多反应性检测。使用了针对传染性疾病因子的单克隆抗体,以确保报道的血清半衰期不受靶介导清除的影响。将16种抗病原体单克隆抗体克隆到IgG1表达载体中,在HEK293细胞中产生,并测试其与(1)一组非同源抗原DNA胰岛素脂多糖(2)杆状病毒颗粒(BVPs)(3)多特异性抗原(PSR);以及(4)HSP90伴侣蛋白的多反应性(S2A)。结果表明PSR和人血清半衰期之间的相关性更强。综合考虑后用PSR评分评估多反应性PSR实验与多反应性的相关性略低于BVPs实验,但是PSR测定通量更高更易操作

 


S2.A不同多反应性检测方法的评估

3、多反应性、疏水性与SHM

PSR实验分析mAb的多反应性来自每个B细胞亚群的12%18%的单克隆抗体表现出一定程度的多反应性(1A)。与其他B细胞亚群相比,幼稚B细胞亚群包含更高比例的多反应性克隆(1A)。基于这一结果,推测SHM可能与LLPC和记忆B细胞来源的mAb的反应性水平降低有关。基于SHM负荷的单克隆抗体聚类表明8.5%缺乏体细胞突变的单克隆抗体表现出高多反应性,只有2%的单克隆抗体具有6-10个氨基酸取代,1.5%的单克隆抗体具有11-20个氨基酸取代,1%的单克隆抗体具有> 20个氨基酸取代(1B)。当对单个B细胞亚群和大量先前描述的抗病毒单克隆抗体进行分析时,观察到了可比较的结果(1C1E)

 


 1人源B细胞抗体的多反应性

A从每个B细胞亚群中分离的显示高和低多反应性的单克隆抗体的百分比(B)根据VH +VL氨基酸取代的数量聚类的具有高和低多反应性的B细胞衍生的单克隆抗体的百分比。(C)根据VH +VL氨基酸取代的数量聚类的具有高和低多反应性的IgG记忆B细胞衍生的单克隆抗体的百分比。(D)根据VH +VL氨基酸取代的数目聚类的具有高和低多反应性的IgM记忆B细胞衍生的单克隆抗体的百分比。(E)根据VH +VL氨基酸取代的数量聚类的具有高和低多反应性的人类B细胞衍生的抗病毒单克隆抗体的百分比。

HIC评估疏水性结果显示80%90%mAb显示出低疏水性。与记忆性B细胞来源的mAbLLPC来源的mAb和临床批准的mAb相比,更大比例的原始B细胞来源的mAb表现出高疏水性。大约12.5%来源于原始B细胞的mAb表现出高疏水性,2%3%来源于记忆B细胞和LLPCsmAb表现出这种特性2A24%缺乏SHMmAb表现出中等至高疏水性,相比之下,只有5%7%的体细胞突变mAb表现出中至高疏水性。2B

总之, 随着SHM水平增加mAb多反应性与疏水性逐渐降低。

 


2.人源mAb抗体的疏水性

A)从每个B细胞亚群分离的显示高、中和低疏水性的单克隆抗体的百分比。还显示了42种临床批准的单克隆抗体的多反应性数据,用于比较。(B)根据VH +VL氨基酸取代的数量聚类的具有高、中和低疏水性的单克隆抗体的百分比。

4、热稳定性与SHM

差示扫描荧光测定法(DSF)测定表观解链温度Tm App),评价抗体的热稳定性。尽管从每个B细胞亚群克隆的绝大多数单克隆抗体的Tm App值与临床批准的单克隆抗体观察到的值相当,但与记忆性B细胞和LLPC衍生的单克隆抗体相比,原始B细胞衍生的单克隆抗体显示出显著更高的Tm App(3A)

IgM记忆b细胞和LLPC细胞衍生单克隆抗体的70°CIgG记忆b细胞衍生单克隆抗体的68­°C相比,幼稚b细胞衍生单克隆抗体的Tm App中位数为74°C(3A)。低水平SHMmAb显示出明显较低的Tm App值。高SHMmAb在热稳定性方面没有显示出实质性的进一步降低。因此,尽管SHM导致抗体热稳定性总体下降,似乎存在体内BCR稳定性阈值。对应于大约60­°C3C)。为了进一步证实SHM导致热稳定性降低,克隆表达了具有不同SHM水平的九种mAb的未突变共同祖先(UCA)并评估它们的热稳定性。与UCA mAb相比,成熟抗体Tm App降低,直接证明了SHM降低了热稳定性(3D)。

 


 3人源mAb的构象稳定性

A从指定的人B细胞亚群中分离的单克隆抗体的TmApp值。(B)根据VH +VL氨基酸取代的数目聚类的人B细胞衍生的单克隆抗体的TmApp值。(C)人类B细胞衍生的单克隆抗体的TmApp值。(D)9种亲和力成熟的单克隆抗体及其相应的未突变共同祖先(UCA)TmApp值。

5、BCR表达水平与SHM

本研究评估了来自高或低BCR密度B细胞的单克隆抗体的SHM水平和热稳定性。本研究未能在流式细胞仪中分离人IgG1lo 细胞所以转而分析了更易分离的鼠B细胞产生的单抗分选具有高hi或低lo水平IgG1BCR成分CD79b的鼠B220+ IgMIgD-Gl7-CD38+ IgG 1+ CD9b+ B细胞,并使用单细胞PCR扩增相应的VHVL区域。从表达IgG1的前5%或后5%B细胞中分离的单克隆抗体的序列分析显示,与具有高BCR表达水平的B细胞相比,具有低BCR表达水平的B细胞编码具有显著更高水平SHM的抗体(4B)比较了不同CD79b表达水平的B细胞的SMH水平(4C)。最后,与来自低BCR密度B细胞的单克隆抗体相比,来自高BCR密度B细胞的单克隆抗体显示出总体更高的Tm App值,这表明BCR表达水平和Fab稳定性之间存在关联(4D)72%来自表达IgG1的前5% b细胞的单克隆抗体的Tm App> 70 ­°C,相比之下,只有45%的单克隆抗体来自表达IgG1的后5% b细胞(4E)。结果表明SHM导致Fab热稳定性降低,并支持体内BCR稳定性阈值的存在。

 


4.从具有高或低BCR表面密度的B细胞中分离的单克隆抗体的测序和热稳定性分析

B)从IgGhiCD79bhiIgGloCD79blo B细胞中分离的单克隆抗体中的体细胞突变负载。(C) IgGhiCD79bhiIgGloCD79blo B细胞中分离的具有指定SHM负荷的单克隆抗体的百分比。(D)IgGhiCD79bhiIgGloCD79blo B细胞中分离的单克隆抗体的TmApp值。(E)IgGhiCD79bhiIgGloCD79blo B细胞中分离的具有所示TmApp值的单克隆抗体的百分比。

6利于可开发性相关的序列特征

按照轻链(LC)类别(VkVl)VH胚系基因家族对抗体进行聚类发现,与含有Vk LCs的单克隆抗体相比,含有Vl LCs的单克隆抗体表现出相似的多反应性和疏水性水平,但热稳定性降低(5A-5C)此外VH胚系基因家族对多反应性几乎没有影响,但对疏水性和热稳定性有显著影响(5D–5F)

按照理论等电点(pI)CDR H3长度对抗体进行聚类。pI较低的mAb相比pI较高的mAb表现出更高的多反应性(5G)pI对疏水性没有实质性的影响相关性在统计学上不显著(5H)。与具有短和中长CDR H3mAb相比,具有长CDR H3mAb显示出显著更高水平的多反应性(5I)。与具有短CDR H3mAb相比,具有长CDR H3mAb也显示出增强的疏水性。(5J)。轻链LC类别、重链可变区VH胚系基因使用、pICDR H3长度对抗体的多反应性、疏水性和/或热稳定性有显著影响。

 


5. 利于可开发性的相关序列特征

A)低水平和高水平多反应性的VkV1单抗的百分比。(B)低、中、高疏水性的VkV1单抗的百分比。(C)VkV1单抗的TmApp值。(D)低水平和高水平多反应性VH1VH3VH4抗体的百分比。(E)低、中和高疏水性的VH1VH3VH4VH1-69单抗的百分比。(F)使用VH1VH2VH3VH4VH5胚系基因家族的单抗的TmApp值。G)理论pIs < 8.0、介于9.09.3之间以及> 9.3的单克隆抗体显示低水平和高水平多反应性的百分比。H)理论pIs <8.0、介于9.09.3之间以及> 9.3的单克隆抗体显示低、中和高疏水性的百分比。ICDR H3长度为7-1415-20> 20个氨基酸的单克隆抗体显示低和高水平多反应性的百分比。JCDRH3长度为7-1415-20> 20个氨基酸的单克隆抗体显示低、中和高疏水性的百分比。

【小结】

本研究对源自不同B细胞亚群的mAb进行多种早期可开发性筛选试验以确定其生物物理特性,并对相应序列特征进行分析揭示了来源于人B细胞的单克隆抗体通常表现出良好的与临床批准的治疗性mAb多为鼠源相当的开发性以及抗体亲和力成熟的过程通常导致特异性的提高与构象稳定性的降低

【原文出处】

Laila Shehata, Daniel P. Maurer, Anna Z. Wec, Asparouh Lilov, Elizabeth Champney, Tingwan Sun, Kimberly Archambault, Irina Burnina, Heather Lynaugh, Xiaoyong Zhi, Yingda Xu, Laura M. Walker, Affinity Maturation Enhances Antibody Specificity but Compromises Conformational Stability,Cell Reports,Volume 28, Issue 13,2019,Pages 3300-3308.e4,ISSN 2211-1247

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.08.056

指导教师:王战辉

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分享中国农业大学沈建忠院士团队王战辉教授课题组抗菌药物环境污染物、激素等小分子化合物半抗原设计、单克隆抗体发现和进化、免疫传感原理和构建、免疫检测技术及产品研发等方面的研究进展。联系方式:zhanhui.wang@foxmail.com
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