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【摘要】
纳米抗体（Nbs）是在骆驼科血清中发现的一种新型抗体，具有体积小、特异性强、稳定性高、易于表达和能识别隐藏的抗原表位等优势，在各个领域具有广泛的应用价值。本文介绍了纳米抗体筛选与优化过程，包括纳米抗体文库构建、体外展示和亲和力成熟3个重要技术阶段的分类与特点。其中，简要描述了天然、免疫及半合成/合成文库的制备方法与重要参数，并系统介绍了多种表面展示系统，以及酵母双杂交、高通量测序和质谱鉴定方法等不同体外展示技术进行快速筛选的其优缺点。介绍了用于提升纳米抗体功能的体外及计算机辅助亲和力成熟技术平台，为获得稳定、可靠、特异的纳米抗体提供了参考。
【引言】
Nbs即重链单域抗体（VHH），晶体直径2.5nm，长4nm，轻链天然缺失，分子量为12−15kDa，是自然存在可以和抗原结合的最小片段。与常规抗体及抗体片段相比，VHH具有较长CDR3区域，可结合到常规抗体难以企及的抗原表位（图1）。此外，经热变性和化学变性后，VHH可以对CDR1和CDR3之间的二硫键进行重新折叠和改造，有助于提高结构稳定性，保证其生物活性。同时，有利于通过提高温度来增强生物识别的动力学研究。
Nbs可实现多价、多副表位和多特异性工程化改造，便于增加亲和力、结合多种抗原或体外亲和力成熟，其简单的分子结构更容易在不同表达系统中大量表达，例如细菌、酵母或哺乳动物细胞。Nbs已被广泛用于科学研究和临床诊治包括正电子发射断层显像（PET）成像诊断、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗、抗病原微生物疗法以及癌症治疗等领域。开展纳米抗体筛选技术研究将有助于加速抗体的获得，而文库构建、体外展示和亲和力成熟作为纳米抗体筛选技术的3个重要阶段，是完成高效、快速筛选技术的关键步骤。本文对3种类型文库——免疫文库、天然文库和半合成/合成文库进行总结，并重点介绍了这8种不同纳米抗体库的筛选技术（图2）。
1纳米抗体库的分类及特点
1.1天然库
收集多个健康、未免疫动物的血液样本分离总淋巴细胞，构建天然文库。由于缺乏体内免疫的亲和力成熟步骤，因此从库容大、多样性高的文库中筛选时才能实现高特异性和亲和力，或需要亲和力进化来获得高结合亲和力。
1.2免疫库
骆驼科动物是纳米抗体文库的主要来源之一，可经过3–4轮免疫后，获得亲和力低至nmol/L或mol/L水平的特异性单域抗体。获取免疫动物的B淋巴细胞，构建针对某抗原的特异性免疫库。VHH基因被扩增并构建至载体中便可利用噬菌体展示技术、细胞表面展示或者可基于mRNA/核糖体展示或质谱鉴定等方法分离高亲和力的Nbs。
1.3合成库与半合成库
半合成文库是天然序列与人工合成的一部分可变区序列的组合，而全合成文库的框架区及可变区则全部由人工合成。构建合成与半合成文库时，应确定框架序列，cAbBCII10被认为是合成文库支架的良好选择。虽然合成与半合成纳米抗体文库可省去动物免疫周期，但关键是对CDR区进行大量而多样化的合理化设计以产生更多的CDR3多态性才能满足文库多样性的需求（表1）。
2纳米抗体体外展示筛选方法以及优缺点
2.1噬菌体展示
噬菌体是在细菌内感染和复制的一种病毒，丝状噬菌体将单链DNA注入靶细菌细胞，随后在宿主细胞质内复制和组装新的病毒粒子。GeorgeP Smith于1985年首次引入噬菌体展示。将外源基因与噬菌体载体III蛋白基因进行融合表达，并随噬菌体组装展示在其头部以连接基因型与表型。噬菌体展示技术通常涉及捕获靶抗原，通过固定在固相载体表面上或与磁珠偶联，经多次洗涤去除非结合的噬菌体，至少进行2−3轮筛选。
2.2酵母展示
酵母表面展示外源蛋白是通过酵母细胞壁蛋白融合来实现的。在大多数酵母展示系统中，展示在酵母细胞壁上的大多数异源蛋白，通过其C末端的糖基磷脂酰肌醇（GPI）共价连接到β-1，6-葡聚糖上，用于展示异源蛋白，包括Aga1、Aga2p、絮凝素等。GPI锚定的蛋白质通过内质网-高尔基体分泌途径转运到酵母细胞表面，并与细胞壁甘露蛋白层形成β-1，6-葡聚糖桥。目前，基于酿酒酵母Aga1-Aga2的酵母展示系统是最受欢迎的系统。其中，Aga2p融合蛋白被编码在工程质粒中，而Aga1被编码在酵母基因组中。两者都在半乳糖诱导的启动子GAL1的控制下表达，二硫键的形成确保了Aga1p和Aga2蛋白的组装效果。该载体具有血凝素标签（HA）和c-myc标签，针对这些标签，可以基于流式细胞术进行筛选。此外，一种或两种外源蛋白可以展示为与酵母Aga2的C端或N末端的融合蛋白（图3）。
2.3酵母双杂交
酵母双杂交系统是鉴定蛋白质-蛋白质相互作用最广泛使用的选择技术，真核生物反式转录激活因子有DNA结合结构域（DNA-BD）和转录激活结构域（DNA-AD），当BD和AD单独作用并不能激活转录反应，当二者接近时激活下游启动子。在酵母双杂交中，需要把目的蛋白A/B分别构建至两种载体中分别表达，A-DB和B-AD的融合蛋白称作诱饵蛋白（bait）。一旦两个靶标蛋白有相互作用，BD和AD距离被拉近即可启动基因表达。通过对报告基因的检测可判断两者之间是否存在相互作用。
2.4核糖体和mRNA展示
核糖体展示具有一个简短的体外翻译过程，文库的两侧必须有一个上游启动子区域和下游携带无终止密码子的间隔区域。DNA文库首先在体外转录成mRNA并翻译，并进行生物素化，通过链霉亲和素包被磁珠捕获核糖体复合物，洗涤除弱非特异性结合的核糖体。对于mRNA展示技术来说，DNA文库在体外转录成mRNA后，经小分子嘌呤霉素连接到mRNA上并进行体外翻译，嘌呤霉素的作用是模拟酪氨酰-tRNA的结构功能，与核糖体A位点结合进而抑制蛋白质翻译。新生的多肽被转移到嘌呤霉素分子上，共价连接的mRNA-蛋白质复合物被分离、逆转录进行筛选。通过在高pH下水解互补的mRNA，可以从靶标结合的复合物中回收DNA链用于PCR扩增（图4）。
2.5细菌展示
大肠杆菌是一种具有细胞质内膜（IM）和外膜（OM）的革兰氏阴性细菌。OM的存在一直是阻碍开发大肠杆菌表面展示的主要障碍，为了将蛋白展示在细菌表面，细胞质中产生的多肽必须通过IM移位，穿过周质并插入OM并将多肽区域暴露在细胞外环境中。研究发现，自动转运蛋白（ATs）可充当“辅助”结构域，协助多肽N末端部分跨OM移位。其中AT序列中C端β桶（β-barrel）结构将多肽与保守的β-arrel组装成BAM复合物，负责内膜β-barrel在OM中的折叠和插入，并参与Ig-like结构域向大肠杆菌细胞表面移位。
2.6哺乳动物细胞展示
哺乳动物细胞包含完整的糖基化修饰、蛋白质折叠功能，是治疗性抗体筛选的理想展示系统。Zhao等使用简并引物将随机CDR序列引入dsDNA，开发了两种新方法：一是将含有重叠序列上下游dsDNA共转染至哺乳动物细胞进行同源重组；二是在体外采用酶切连接的方式生成全长序列，转染至细胞中用于文库表达。由于哺乳动物细胞转染效率低、抗体易组装错误、轻重链表达不一致等，对后期筛选产生一定的干扰。后续可利用流式细胞荧光分选技术（FACS）筛选、监测高亲和力抗体的生成。此外，哺乳动物细胞是展示跨膜蛋白和作为细胞表型调节剂的理想平台。Schmidt等开发了一种人体细胞的慢病毒筛选方法，以制备抗病毒Nbs。VHHs免疫原性更低、更稳定，其效能优于scFvs，也可用于修饰具有适合癌症免疫治疗的CAR-T细胞。
2.7高通量测序和质谱分析
高通量测序和质谱鉴定技术避免了体外构建展示文库和筛选等过程，因而能够在较短时间内快速筛选到针对多个表位的Nbs。通过巢式PCR获得VHH区域并进行高通量测序，在血清中对HCAb及常规抗体进行亲和纯化，分离含VHH的HCAb。采用木瓜蛋白酶切割恒定区，保留VHH区最小片段进行液相色谱-质谱进行分析。最后，通过原核表达和表面等离子体共振或其他技术进一步评估其表达能力与亲和力（表2）。
3纳米抗体体外亲和力成熟方法
3.1亲和力成熟
体液免疫中再次应答所产生抗体的平均亲和力和特异性高于初次免疫应答，这一过程被称为亲和力成熟。体内亲和力成熟离不开两个过程，一是骨髓抗体轻重链的胚系基因片段经V-（D）-J随机重排组合，其次是互补决定区CDR发生高频突变，滤泡树突状细胞进行高亲和力抗体筛选。来源于天然抗体库中的抗体亲和力水平与动物在初次免疫应答后获得的抗体亲和力水平相当。因此，研究人员通过模拟体内亲和力成熟过程，对抗体基因进行相应突变并进行体外亲和力成熟的研究。
抗体体外亲和力成熟包括随机突变、定点突变以及高通量合成等多种方式，CDR是突变关键区域。通过体外亲和力成熟技术可以提高抗体药物的亲和力，从而减少其注射剂量，降低副作用，降低治疗成本。
3.2多聚化与多特异性
由于VHH具有高溶解度、单域结构和单基因编码的特性，研究人员通过基因编码的氨基酸接头或载体蛋白制备多聚体VHH。这种多聚化策略不仅操作简单，而且通过引入亲和效应和多特异性显著增强了VHH的功能。其基本原理为VHH结构中仅有一个结构域可以插入氨基酸柔性Gly-Ser接头，已有研究证明，纳米抗体多聚化可以提高与靶蛋白的亲和力。
3.3计算机辅助亲和力成熟
随着计算生物学的快速发展以及算法优化和计算能力的提升，基于三维结构的体外亲和力成熟策略也取得了显著进展。VHH适用于X射线晶体学和核磁共振分析，能够精确揭示其与靶分子的相互作用机制。借助不同的算法，研究人员可以更深入地了解抗体-抗原的结构及其相互作用，并分析参与分子间相互作用的关键残基。Sulea等人开发了用于抗体和蛋白质治疗药物设计的辅助平台，并成功应用于VHH的亲和力成熟研究，使突变体的亲和力常数（KD）提高了9.4倍。
4 小结与展望
纳米抗体由于其较小的分子尺寸、单体结构、高度稳定性、高溶解度、强穿透性、低免疫原性以及快速生产周期，已成为众多治疗和生物技术应用的理想选择。此外，基于多价、多特异性纳米抗体及其修饰结构的生物制剂，已在免疫性疾病、肿瘤、神经系统疾病、血液病和传染病等领域进入不同临床试验阶段。目前，针对SARS-CoV-2的多特异性中和抗体已进入多个临床阶段，旨在克服病毒突变带来的耐药性问题，从而抑制变异毒株的传播和生存。其中，Caplacizuma是首个用于治疗成人罕见的获得性血栓性血小板减少性紫癜的纳米抗体药物，标志着纳米抗体在医学应用中的重要里程碑。而KN035恩沃利单抗是全球首个获批上市的单域抗体免疫治疗药物，且为唯一批准用于晚期结直肠癌治疗的皮下注射PD-（L）1抗体。虽然目前尚无其他基于纳米抗体结构的药物被批准用于癌症治疗，但基于该领域的大量前沿研究，未来可预见更多多聚纳米抗体分子将进入后期临床试验。
快速、稳健的高亲和力纳米抗体筛选技术对于其广泛应用至关重要。不同的体外展示系统各具优势，文库的规模对展示技术的成功尤为关键。然而，目前尚无单一的展示系统能够同时满足高产率和高通量筛选的要求。现有展示方法仍需进一步优化，以在未来的治疗、诊断及研究中发挥更大作用。抗体文库筛选得到的抗体在亲和力和特异性上具有显著差异，这将直接影响其在抗原结合、药代动力学和安全性等方面的应用。因此，体外亲和力成熟技术可进一步优化抗体性能，以满足特定应用需求。
尽管纳米抗体的结构相对简单，通过多聚化和多特异性的设计可快速增强其功能效力。近年来，基于计算机辅助的亲和力成熟技术受到了广泛关注，这些技术能够改善纳米抗体的亲和力、特异性、热稳定性和人源化特性。通过整合不同的算法，计算机辅助方法能够经济高效地在短时间内获得优化的突变体，同时深入分析抗体-抗原相互作用的结构基础，从而实现亲和力的显著提升。
原文链接：纳米抗体筛选技术研究进展 - 中国知网 (cnki.net)
指导教师：王战辉
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