摘要：纳米抗体是从骆驼重链抗体中提取的最小功能性抗体片段，已成为各种生物医学应用的有力工具。这篇综述中讨论了纳米抗体的结构特征、功能特性和计算方法，这些方法推动了合成纳米抗体的设计和优化。主要探索了纳米抗体独特的抗原结合域，强调了互补决定区在靶标识别和特异性中的关键作用。这篇综述进一步强调了纳米抗体相对于传统抗体从生物合成角度的优势，包括它们的体积小、稳定性和溶解性，这使它们成为诊断、治疗和生物传感中理想候选物。讨论了纳米抗体建模、表位预测和亲和力成熟的计算方法的最新进展，揭示了它们复杂的抗原结合机制和构象动力学。最后，研究了一个直接的例子，说明如何实施计算设计策略来改进一种基于纳米抗体的免疫传感器，即Quenchbody。通过结合实验结果和计算见解，本综述阐明了纳米抗体在生物技术和生物医学研究中的变革性影响，为未来医疗保健和诊断领域的进步和应用提供了路线图。
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【引语】
人类和其他哺乳动物中发现的传统抗体是 Y 形分子，由多个结构域组成（图 1）。每个抗体由两条相同的重链（包含 VH、CH1、CH2 和 CH3 结构域）和两条相同的轻链（包含 VL 和 CL结构域）组成。重链恒定结构域 CH2 和CH3 构成可结晶片段，称为 Fc。Y 形结构的臂称为抗原结合片段 (Fab) 区，由两个重链可变结构域 (VH) 和两个轻链可变结构域 (VL) 以及两个恒定区 (CH1 和CL) 组成。抗原结合位点也称为互补位，位于抗体臂的尖端，在重链 (VH) 和轻链(VL) 的可变结构域形成的口袋或凹槽内。这些结合位点由六个高变环组成，其长度和氨基酸组成不同，通常称为互补决定区 (CDR) 环。重组抗体片段，例如 Fab 和单链可变片段 (scFv)，以及纳米抗体（图 1）和多价工程变体，正逐渐被认可为有效的抗原结合剂。这些片段保持了完整单克隆抗体的靶向特异性，同时具有适用于各种诊断和治疗应用的独特和优越特性。它们被用作诊断体外成像和诊断的示踪剂、生物传感器，以及开发针对各种疾病的治疗方法，包括癌症和SARS-CoV-2。![]()
图1. 常规抗体、重链抗体和纳米抗体以及抗体片段的图形表示。纳米抗体（青色）结合溶菌酶（灰色）的三维结构，显示了三个 CDR 环和二硫键（PDB ID：1ZVH）。
纳米抗体因缺乏轻链而也称为 VHH 或单域抗体，是从仅有重链的抗体中提取的小抗体片段。它们于1993年首次在骆驼血清中被发现，但也存在于其他骆驼科动物中，如骆驼和羊驼，以及鲨鱼。它们只有三个CDR环，仅凭其可变的单域就足以结合抗原，结合亲和力可与单克隆抗体相媲美。纳米抗体甚至能够与蛋白质表面裂缝中埋藏的隐藏表位相互作用，而这些表位是常规 VH-VL 对无法接近的，例如在酶活性位点和 SARS-CoV-2 刺突蛋白中发现的表位。与抗体一样，纳米抗体含有免疫球蛋白样β夹层支架，该支架由反向平行的β链组成，排列成两片，并由内部二硫键连接在一起（图 1）。该结构框架为构成结合表面的三个CDR提供了稳定性，结合表面可被视为与传统抗体的互补位同义。这些CDR环具有可变的长度、组成和结构，其中CDR-H3的序列变化最大，长度从12到18个残基不等，因此被认为是抗原结合特异性的最大贡献者之一。值得注意的是，纳米抗体通常具有比抗体更长的 CDR-H3环，并且可以采用连接或延伸构象，从而使纳米抗体能够进入具有指状抗原结合互补位的结合口袋，而传统抗体的重链和轻链互补位中的短环对应物则无法进入。因此，纳米抗体中的CDR-H3环比抗体中的CDR-H3环占据更大的构象空间，因为它们不受成对的轻链结构域的限制。纳米抗体的CDR-H3通常占整个互补位内所有结合相互作用的 50%以上。纳米抗体的其余部分由四个区域组成，这些区域的序列和结构比传统抗体更保守，称为框架区。纳米抗体中与传统抗体中的VH-VL 界面相对应的区域的亲水性超过了在其他抗体片段（如Fab和scFv）中观察到的亲水性。这一特性减轻了自缔合或二聚化，从而确保了纳米抗体以单体状态保存。总体而言，纳米抗体互补位在结构片段、用于抗原相互作用的残基以及与抗原建立的接触种类方面表现出比传统抗体互补位更大的多样性。与传统抗体（MW：~ 150 kDa）相比，纳米抗体具有多种优势，包括其分子量小，约为 110个氨基酸（MW：~ 12-15 kDa）、稳定性和溶解性好，同时保留了与抗体类似以高亲和力结合靶标的能力。此外，它们还因其良好的生化特性而备受关注，包括高热稳定性、深层组织穿透性和低免疫原性。此外，纳米抗体可以通过细菌表达系统在周质中或通过无细胞方法经济地大量生产，从而有助于在纳米抗体结构内准确形成二硫键，而较大的抗体通常需要在昂贵的真核表达系统中生产。由于这些有利的特性，纳米抗体及其衍生物越来越多地用于众多生化应用，它们可以很容易地替代传统抗体。它们还被用作新工具来解决传统抗体无法解决的研究问题，例如稳定蛋白质构象状态和动力学，以及控制G蛋白偶联受体的变构调节。纳米抗体也被用作载体蛋白，用于简便检测与免疫检查点蛋白程序性死亡1 (PD-1) 结合的肽。乐高抗体（由纳米抗体、Fab和融合蛋白组成的复合物），以及巨抗体（嫁接到球状刚性细菌蛋白上的纳米抗体）被用于增加粒子质量，以便通过单粒子低温电子显微镜确定小蛋白质的结构。最近开发的一种名为 Nanobody-NanoBRET (NanoB2) 的方法利用纳米抗体作为荧光探针，结合基于纳米荧光素酶的生物发光共振能量转移 (NanoBRET)来研究配体与膜蛋白的结合。纳米抗体的广泛生化用途需要创造能够与多种分子靶标结合的新型纳米抗体。纳米抗体通常可以通过用靶抗原免疫动物（通常是骆驼科动物，如美洲驼或骆驼）来获得。然而，随着定向进化的最新进展，纳米抗体文库可以在数周内完全合成生成。这些文库通常在主 CDR-H3 的长度上有所不同，从而产生三个独特的相互作用表面：凹面、凸面和凸面互补位。它们可用于选择针对目标蛋白质的结合剂，包括膜蛋白和罕见构象状态。除了在基础生化研究中具有明显用途外，纳米抗体还越来越多地被用作诊断工具、分子成像探针和治疗剂。它们目前正在针对多种人类疾病进行临床研究，包括乳腺癌、脑肿瘤、肺部疾病和传染病。纳米抗体还可以靶向各种肿瘤，并用于前列腺癌的诊断和治疗。自2019年以来，尤其是随着COVID-19大流行，包括计算蛋白质设计在内的多项研究已经出现，旨在研究纳米抗体作为抗病毒药物的潜力。纳米抗体经过设计，专门针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白的受体结合结构域，包括Omicron变体的受体结合结构域，以阻断其与人类血管紧张素转换酶2的相互作用。通过与刺突蛋白结合，纳米抗体会干扰病毒感染人体细胞的能力，并可能中和其传染性。尽管纳米抗体作为传统抗体的替代品具有广阔的潜力，但它们也存在一些局限性。这些局限性包括用成像剂标记时结合特性的变化、放射性标记的纳米抗体在肾脏和肝脏中的高摄取率，这使病变检测变得复杂并导致器官暴露，以及纳米抗体在肾脏中的快速排泄，降低了针对疾病部位的疗效。目前可用的实验性纳米抗体-抗原结构也相当有限。虽然实验结构数据仍然非常宝贵，但计算建模和设计提供了一种理解纳米抗体-抗原相互作用的补充方法，尤其是在缺乏实验结构的情况下。这些方法加速了对多种抗原具有高特异性和亲和力的纳米抗体的发现、优化和重新设计。已经审查了用于抗体建模、开发和用于COVID-19 研究和新兴疗法的蛋白质设计的基于计算和人工智能的方法。对于纳米抗体，还回顾了能够实现精确和稳健靶标结合的结构特征，重点介绍了用于识别、结构分析和人源化的新兴技术。同样，最近在其他地方也回顾了允许快速识别靶标特异性纳米抗体的不同策略和扩大其应用的工程技术。在这里，我们回顾了计算建模和设计策略，以帮助利用计算方法开发下一代基于纳米抗体的治疗方法和生物技术解决方案。具体来说，我们将重点介绍纳米抗体抗原结构预测、相互作用、结合亲和力和纳米抗体设计的计算方法的最新发展。【纳米抗体数据库】
纳米抗体数据库在提供研究资源和信息、促进纳米抗体开发、实现靶标发现和验证以及支持比较分析方面发挥着重要作用。大多数可用数据库主要包含抗体数据，有些还包括纳米抗体信息。近年来，随着研究和实际应用的进步，纳米抗体相关数据的收集显著增加。这些丰富的信息促进了专门为纳米抗体设计的数据库的扩展。免疫信息学纳米抗体综合数据库 (INDI) 包含超过1100万个纳米抗体序列。其搜索工具可在INDI数据库中找到最接近匹配的变量序列，而CDR-H3搜索工具则可帮助定位具有与查询序列相似的CDR-H3 区域的纳米抗体。结构抗体数据库SAbDab-nano是SAbDab的一个显式纳米抗体跟踪子数据库，截至2024年3月，包含1454种纳米抗体结构，每周更新一次。此外，还有一个非冗余数据集，包含123个纳米抗体-抗原晶体结构，包括其氨基酸序列和带注释的CDR区域。此外，还列出了相互作用特性，包括分子间相互作用的数量、实验结合亲和力和复合物解离后溶剂可及性的变化。为了应对不同数据库之间数据异质性、不一致性和缺乏互操作性所带来的挑战，开发了一个称为纳米抗体库和档案系统 (NanoLAS) 的新数据库。NanoLAS集成并标准化来自多个数据库的纳米抗体数据，为数据查询和分析提供了一个用户友好、高效且交互式的平台。作为现有结构和序列数据库的补充，NbThermo 是一个开创性的数据库，汇编了数百种纳米抗体的熔化温度 (Tm) 数据。其关键作用延伸到开发用于纳米抗体工程中精确Tm预测的算法，以及了解纳米抗体热稳定性的复杂结构基础。虽然熔化温度较低和较高的纳米抗体框架的序列模式似乎没有明显差异，但很明显，高度可变的环在定义热稳定性方面起着至关重要的作用。【纳米抗体建模的计算方法】
1、纳米抗体-抗原复合物的结构预测
纳米抗体结构的预测仍然是一个挑战，特别是 CDR 环构象的准确预测。具体来说，CDR-H3是长度和氨基酸组成变化最大的环，也是最难预测的。已经开发了几种机器学习方法来促进纳米抗体结构的预测和设计。AlphaFold 2.2 版用于建模纳米抗体结构，与实验结构相比，发现它可以正确预测CDR-H3环构象]。最近开发的工具ImmuneBuilder预测CDR-H3环的平 RMSD为 2.9 Å，比AlphaFold 2 提高了0.5
Å。专门针对纳米抗体结构预测进行训练的NanoNet可提供快速（每个纳米抗体几毫秒）和高效的结构预测，从而实现高通量结构建模。为了评估纳米抗体的整体结构灵活性和局部构象，对实验确定的结构和NanoNet 预测的模型进行了MD模拟。值得注意的是，CDR-H1和CDR-H3的很大一部分收敛到不同的构象。这凸显了纳米抗体建模的复杂性，强调静态实验得出的“快照结构”可能无法全面捕捉纳米抗体采用的所有不同构象。IgFold是一种快速而精确的深度学习方法，旨在根据序列信息预测抗体和纳米抗体结构。IgFold预测的准确性与最近的AlphaFold
2模型一致，但运行速度明显更快。Evolvex是一种最新的计算机纳米抗体设计流程，它使用经验力场FoldX来设计CDR区域。使用这种方法，设计了针对蛋白质靶标上预定义表位的高亲和力、特异性和稳定性纳米抗体。AbNatiV是一种新开发的深度学习工具，它可以评估抗体和纳米抗体的天然性，预测免疫原性的可能性，并提供残基水平的概况，以指导设计与免疫系统衍生的抗体和纳米抗体非常相似的抗体。另一个挑战是预测抗体和纳米抗体-抗原复合物的结构和结合亲和力。虽然预测纳米抗体-抗原复合物的对接和相互作用表面的识别仍然具有挑战性，但一项研究表明，使用经验Dreiding力场来计算纳米抗体-抗原复合物中的相互作用能是有效的。这种方法对于重现对接软件 zdock预测的实验结合姿势特别有用。数据驱动的对接网络服务器 Haddock也被广泛用于预测抗原与其纳米抗体的结合。与其他对接方法相比，它表现出卓越的性能并产生更高精度的模型。HDOCK被发现是最适合将新型纳米抗体对接至 SARS-CoV-2 受体结合域的程序，且准确度较高。虽然 RosettaAntibody也被用于预测纳米抗体-抗原复合物，但目前正在进行研究，旨在提高其CDR-H3环建模的准确性和速度。PatchDock采用一种能够自动检测抗体CDR的算法，并将搜索限制在这些特定区域，现已集成到计算对接和设计工作流程中。在此工作流程中，PatchDock生成的对接姿势与天然姿势非常相似。一项基准研究表明，AlphaFold 2.3.0 版将近天然纳米抗体-抗原建模的成功率提高到27%，而抗体-抗原复合物的成功率为14%。虽然27%的成功率可能仍然很低，但与之前的AlphaFold 2.2版相比，这是一个显着的改进。纳米抗体-抗原复合物的建模性能优于抗体-抗原复合物，这是因为CDR环的数量较少，因此搜索空间较小。最近，一种利用AlphaFold
2进行积极采样的方法（称为 AFsample）成为CASP15中多聚体预测的最佳方法。它能够通过广泛采样来提高生成模型的质量（DockQ 得分=
0.55），与AlphaFold-Multimer v2（DockQ得分= 0.41）相比有显着改善。在这篇评论文章的最终审查期间，AlphaFold 3发布了。与AlphaFold-Multimer
v2.3相比，它在抗体抗原预测准确性方面取得了显着进步。2、使用分子动力学模拟探索纳米抗体和纳米抗体-抗原相互作用
分子动力学 (MD) 模拟对于研究纳米抗体-抗原相互作用和动力学非常有价值。这些模拟提供了独特的见解，可以识别纳米抗体-抗原结合后CDR 环灵活性的变化，并阐明纳米抗体-抗原相互作用背后的分子机制，提供补充实验观察的观点。整合计算和实验方法可以增强我们对这些相互作用的理解，从而促进纳米抗体的合理设计。MD模拟已用于探索接头长度和灵活性对二价纳米抗体结构的影响，二价纳米抗体由两个通过接头连接的纳米抗体组成。研究结果表明，无论接头长度如何，柔性接头都能增强二价纳米抗体的结合亲和力，而刚性接头需要理想的长度才能获得最佳性能。他们还促进了一种新型纳米抗体探针的设计，用于检测人类染色质中天然存在的DNA G-四链体结构。MD 模拟最近被用于了解高亲和力纳米抗体的结合机制，该抗体旨在检测人类免疫缺陷病毒感染的最早标志物之一 p24。模拟表明，结合发生在p24上带负电荷的区域，并由纳米抗体结合界面的正表面补充，其中涉及CDR 环。这些模拟还强调了盐桥相互作用、氢键和静电互补区域在促进高亲和力结合方面的重要性。此外，MD 模拟已与现有的 NMR 和X射线晶体学数据结合使用，用于研究人类朊病毒蛋白(HuPrP) 及其两种与疾病相关的突变体 (E219K和V210I)。这些模拟阐明了HuPrP及其突变体在与相关纳米抗体结合之前的动态构象景观。先前的研究已经强调了纳米抗体通过独特地稳定两个无序表位来抑制体外朊病毒聚集的能力。在模拟过程中，观察到了实验确定的在预先存在的构象状态集合内的结合能力构象。这一观察结果强调了关键残基 Met166 在构象变化和纳米抗体结合中的重要性（图 2A）。间接抗原结合，纳米抗体的高温 MD 模拟揭示了 CDR-H3 残基以及 CDR-H3 与框架残基之间的相互作用对于维持高温下VHH 结构稳定性的重要性。引入破坏这些相互作用的突变会导致亲和力和热稳定性的显着丧失。人们认为高温 MD 模拟（400
K）可以增强动力学，而不会扰乱纳米抗体的结构。天然原子接触的比例 (Q) 与实验确定的熔化温度 (Tm)显示出良好的相关性。亲水残基的 Q 值表现出更好的相关性，这表明纳米抗体的稳定性与亲水残基的有利相互作用相关（图 2B）。![]()
图2. (A) 参与 E219K HuP 构象变化的关键残基 Met166 的Φ和Ψ二面角分布图。黑点表示来自 MD 快照 (apo MD) 的Φ和Ψ对；粉色点表示从 NMR 结构 (apo NMR) 中提取的Φ和Ψ对；绿点表示从模拟的 E219K HuP 与纳米抗体结合 (holo MD) 中提取的Φ和Ψ对；绿色背景的蓝色方块表示WT HuP 与纳米抗体结合的X射线晶体结构 (holo XRD) 中提取的Φ和Ψ对。 (B) 在 400 K 模拟中，最后30 ns内的平均天然原子接触 (Q)与每组对的实验Tm的标准偏差。亲水-全部组是亲水残基（Asp、Glu、Gln、Asn、Arg、Lys 和 His）与所有残基的平均Q值，全部-全部组是常规平均Q值，疏水-小组是疏水残基（Phe、Tyr、Trp、Leu、Val、Ile、Met、Cys 和 Pro）与小残基（Gly、Ala、Ser 和 Thr）的平均Q值。
3、利用增强采样模拟探索纳米抗体-抗原复合物的构象动力学
与传统 MD 模拟相比，增强采样模拟可更有效、更全面地探索纳米抗体的构象空间。它们旨在克服标准模拟的局限性，标准模拟可能无法充分采样稀有或高能构象。高斯加速 MD (GaMD) 是一种增强采样技术，其工作原理是应用谐波增强电位来平滑能量表面、降低系统能垒并将结构动力学加速几个数量级。研究纳米抗体与G蛋白偶联受体 (GPCR) 结合的GaMD模拟表明，受体的正交配体结合口袋发生了变构闭合，与最近的实验结果一致 (图 3A)。在没有纳米抗体结合的情况下，受体的正交口袋采样了开放和完全开放的构象(图 3B)。这些模拟为GPCR-纳米抗体结合的复杂机制提供了宝贵的见解，展示了GaMD在有效模拟动态蛋白质-蛋白质相互作用方面的能力。加速 MD 还用于研究免疫检查点PD-L1 结合域的构象动力学。在 PD-L1晶体结构和MD 轨迹中观察到的最大结构位移主要由特定环引起，特别是当PD-L1 与其纳米抗体结合时（图 3C）。主成分(PC)得分图确定了三个高密度区域，它们都代表开环构象（图 3D）。这凸显了针对靠近这个柔性环的区域的潜在好处，并且可以成为变构小分子配体的良好靶点。与传统的MD模拟相比，GaMD 虽然提高了采样效率并降低了计算成本，但它遇到了与采样不足相关的挑战。这阻碍了研究大型复杂系统或跨越数百毫秒的事件所需的收敛自由能曲线的计算。为了解决这个问题并保持准确的自由能计算，提出了将 GaMD 与副本交换算法相结合的方法。![]()
图3. 使用GaMD 模拟计算的 Tyr104-Tyr403-Tyr426 三角形周长与纳米抗体的 RMSD 之间的二维平均力势，相对于 X 射线构象 (A) 纳米抗体结合时，低能构象状态为闭合。(B) 纳米抗体未结合时，显示两种低能构象状态，即打开和完全打开。(C) 游离 PD-L1 (PDB ID：4Z18，青色) 与与其纳米抗体共结晶的 PD-L1 (PDB ID：5JDS，黄色) 的叠加结构。图片改编自参考文献。 (D) 从 GaMD 模拟中提取的 PD-L1 结构的 PC 得分图，投影在两个最大的主成分 (PC1 和 PC2) 上。该图给出了低能量 (高密度) 环构象的代表性结构。
4、估计纳米抗体-抗原复合物的结合亲和力
估计纳米抗体-抗原复合物的结合亲和力是了解其相互作用、优化其治疗或诊断潜力以及识别导致某些疾病的突变的关键方面。虽然实验技术通常被用作定量评估结合亲和力的金标准，但计算方法可以提供对结合相互作用的宝贵见解，从而有助于发现新的或改进的亲和力结合物，特别是在实验数据有限或获取成本高昂的情况下。例如，可以使用计算工具通过亲和力成熟、CDR交换诱变或多价纳米抗体的设计来提高纳米抗体-抗原结合亲和力。炼金术结合自由能扰动计算用于估计纳米抗体残基突变引起的抗原结合自由能变化。纳米抗体-抗原复合物之间的结合自由能也可以通过分子力学/泊松玻尔兹曼表面积(MM/PBSA)或分子力学/广义玻恩表面积 (MM/GBSA)方法或对接评分函数进行MD模拟来计算。实验测量反映了大量结合事件的平均值，而MD可以构建平衡集合，以准确评估纳米抗体-抗原复合物。基于这个集合而不是单一配置来评估结合亲和力，特别是对于缺乏结构信息的复合物，可以最大限度地减少潜在错误。最近开发的无监督结合能预测工具DSMBind优于大多数无监督方法，并且与监督模型的性能相匹配，尽管在训练期间没有使用任何结合亲和力标签。其设计能力通过PD-L1纳米抗体设计任务得到了展示。在这里，所有三个CDR都是随机的，并根据DSMBind 评分选择了最佳CDR序列。然后对设计的纳米抗体进行实验测试，并成功发现一种新型PD-L1特异性结合剂。虽然预测纳米抗体和抗体抗原亲和力的计算方法已经取得了长足的进步，但仍在不断发展以进一步提高准确性。该领域正在迅速发展，机器学习算法的集成度不断提高，这表明未来亲和力预测将朝着更精确、更可靠的方向发展。【纳米抗体设计的计算方法】
1、基于结构和片段的纳米抗体设计
基于结构的纳米抗体设计涉及合理的工程改造和修饰，以增强结合亲和力、提高稳定性、降低免疫原性、微调生物物理特性或针对特定应用进行定制。例如，将纤维封端淀粉样蛋白抑制剂(VDW、W3 和 WIW) 的序列嫁接到先前报道的纳米抗体CDR-H3 支架(PDB ID: 6HEQ) 上，以阻止与阿尔茨海默病相关的tau 聚集 (图 4A)。此外，还设计了一种双特异性纳米抗体，将血脑屏障靶向纳米抗体(IR5，一种靶向1型胰岛素样生长因子受体的纳米抗体)与WIW tau 封端纳米抗体抑制剂通过柔性接头(Gly4Ser)3连接起来。这种纳米抗体表现出更好的血脑屏障穿透性，为抑制神经退行性疾病中朊病毒样tau的播种提供了一种有希望的途径。合成纳米抗体库的设计有两个关键要素：框架选择和CDR 设计。选择了来自重组抗鸡溶菌酶纳米抗体cAbBCII10 的具有高稳定性的VHH 框架，CDR-H1和CDR-H2 保持cAbBCII10 的固定长度，而CDR-H3 具有 14个单位的环以建立凸结合位点拓扑（图 4B）。在 cAbBCII10 晶体结构分析的指导下，确定了随机化的位置，调整密码子的使用以确保稳定性（图 4B）。这包括在关键位置保留特定氨基酸以促进稳定性，强调溶剂暴露位置的极性，并排除不稳定的氨基酸。该设计策略可用于具有不同CDR-H1-3 长度的其他稳定框架。为了克服AlphaFold 2 在预测抗体抗原结构方面的局限性，最近，人们开发了一种经过微调的RoseTTAFold2 和RFdiffusion 网络，用于从头设计纳米抗体。设计的复合物显示出对CDR 环和整体结合方向的准确预测。该方案有望成为未来基于结构的纳米抗体和抗体抗原设计的基础。除了基于结构的纳米抗体设计外，还可以使用基于片段的方法，包括识别和优化纳米抗体序列内较小的抗原结合片段。最近，人们开发了一种基于片段的方法，该方法涉及纳米抗体结合环的组合设计及其嫁接到纳米抗体支架上（图 4C）。生物物理表征表明，所有设计都表现出稳定性，并能有效地与预期的目标人血清白蛋白结合，亲和力在纳摩尔范围内。该策略将促进与预选表位结合的先导纳米抗体的产生。![]()
图4. (A) WIW 纳米抗体抑制剂的 X 射线晶体结构显示其 CDR。CDR-H1 为绿色，CDR-H2 为蓝色，CDR-H3 为红色（PDB ID：8FQ7）。(B) AbBCII10 结构（PDB ID：3DWT）。CDR-H1、CDR-H2 和 CDR-H3 分别以蓝色、绿色和红色表示。CDR-H1 和 CDR-H2 中的彩色球体代表随机位置，而灰色球体代表保持固定的 CDR 位置。(C) 将设计的 CDR 基序移植到抗体支架上。人血清白蛋白 (HSA) 的结构以灰色显示，选择用于实验验证的设计 CDR 基序以蓝色、黄色和紫色显示，停靠在各自的表位上。两个片段（蓝色）被移植到纳米抗体支架的单独 CDR（CDR-H1 和 CDR-H3）中。黄色和紫色基序则被移植到可抵抗 CDR-H3 替换的支架的 CDR-H3 中。
2、纳米抗体的计算亲和力成熟
纳米抗体的计算亲和力成熟是指利用计算技术通过迭代设计和优化纳米抗体序列或结构来增强纳米抗体的结合亲和力以改善其与靶抗原的相互作用的过程。计算方法可以探索广阔的序列和结构空间，以识别突变、修饰或非天然氨基酸掺入，从而增强纳米抗体的结合亲和力，同时保持特异性和稳定性。基于MD模拟、分子对接评分、FoldX稳定性预测、CamSol和A3D溶解度估计的计算协议可产生准确的评分方法，用于预测实验产量并识别突变引起的结构修饰。NanoBERT是一种最近开发的深度学习模型，可用于根据纳米抗体的序列预测其生物学上可行的突变。利用同源性建模构建了靶向 CD20（一种在非霍奇金淋巴瘤的 B 细胞上高表达的磷蛋白）的纳米抗体的三维结构，然后进行分子对接计算以观察其与CD20的相互作用。确定关键残基后，利用实验设计（田口方法）引入一些突变，旨在提高纳米抗体对CD20的结合亲和力。根据实验设计提出的突变，开发了两种优化的纳米抗体结构，其中一种表现出显著增强的结合亲和力。该纳米抗体的序列已存入 INDI 存储库并获得专利（登录号 US20180079822），对其 MD模拟显示 CDR-H1 和CDR-H3 是识别抗原的重要环。在最近的一项研究中，结合计算机蛋白质设计的各种实验方法被用于开发特定的纳米抗体，这些抗体可以识别转录因子 BCL11A 的C端锌指之一，而BCL11A是从胎儿型血红蛋白到成人型血红蛋白转变的关键调节因子。为了增强它们的亲和力，在锌指结构域之前和之后引入了环。然后使用 rosetta 软件通过在相互作用界面引入突变来重新设计蛋白质（图 5）。在设计阶段之后，评估了诸如 rosetta 分数、RMSD、接触埋藏的溶剂可及表面和结合能变化等关键指标，以对设计进行排名。随后，发现具有M45D突变的纳米抗体在实验中提高了结合亲和力。在另一项研究中，利用多算法交叉筛选 (VIMAS) 识别了应赋予原始纳米抗体更高亲和力的突变。VIMAS 是一种结合了三个不同平台（mCSM-AB、OSPREY 和 FoldX）结果的方法，它们使用替代算法来预测突变对亲和力的影响。在该策略中，每个氨基酸依次突变为17种氨基酸（不包括 Cys 和 Pro），并计算相对于母体纳米抗体的结合亲和力变化。然后利用伞形采样模拟的平均力势计算新纳米抗体-抗原复合物的结合自由能。这使得能够鉴定出一种双特异性构建体，该构建体能够同时结合两种临床相关抗原肿瘤坏死 α 和白细胞介素23。为了准确评估来自蛋白质序列的纳米抗体多反应性并预测氨基酸突变对多反应性的影响，最近开发了一种在多样化的幼稚合成纳米抗体库上训练的机器学习模型。总之，计算和实验方法的跨学科应用显著提高了纳米抗体对治疗靶点的亲和力和特异性，为开发改进的治疗方法提供了光明的前景。实施深度学习方法有可能显著缩短抗体和纳米抗体的计算机成熟流程的总体时间线。然而，目前的限制在于缺乏足够的数据。因此，基准测试工作将被证明在收集必要数据以确定真正的最新技术并确定需要重点研究的领域方面非常有价值。![]()
图5. 锌指 (ZF) 与 M45D 突变纳米抗体和 BCL11A 复合的结构。M45D 以绿色显示，ZF 以洋红色显示，BCL11A 以黄色显示。
3、淬灭体的计算设计
2011 年，Ueda 及其同事推出了一种创新的生物传感器，称为Quenchbody (Q-body)。Q-body 是一种免疫传感器，设计用于针对一系列抗原（包括小分子）的非竞争性均质检测。该技术的关键方面是用荧光染料标记抗体片段，该染料被抗体片段中内在暴露的色氨酸残基淬灭。当这些抗体片段与抗原结合时，荧光染料分子在空间上被遮挡并远离淬灭色氨酸，导致荧光强度增加。通过荧光强度变化检测抗原简单、易于操作且灵敏度高。为使荧光猝灭和抗原依赖性去猝灭最大化，人们研究了染料结构选择、将染料连接到抗体片段的连接体的组成（长度和灵活性）以及关键猝灭色氨酸的位置。迄今为止，已开发出针对目标抗原的各种Q体形式。其中包括基于 scFv 的Q体，用于检测抗抑郁药氟伏沙明和促炎细胞因子肿瘤坏死因子α。此外，还有基于 Fab 的Q体（也称为超Q体），可检测高度成瘾的精神兴奋剂甲基苯丙胺、大麻草和淀粉样蛋白β寡聚体，以辅助诊断阿尔茨海默病。最后，基于纳米抗体的微型Q体已开发出来，可检测小半抗原甲氨蝶呤、溶菌酶和重组人生长激素及其同工酶。与基于scFv的Q体相比，基于Fab的Q体在与抗原结合时通常会表现出更显著的荧光增加。与基于scFv或Fab 的淬灭体相比，基于纳米抗体的Q体具有多种优势。它们具有更高的稳定性、更强的对突变的耐受性，并且更容易生产。抗体Fab和纳米抗体片段也易于转化为卷曲Q体 (CQ体)，这是通过增加由接头结合的E4和K4组成的稳定卷曲螺旋肽对来实现的。K3或K4螺旋与共价连接的荧光团的结合策略性地将荧光染料置于理想的淬灭位置，促进了通过非共价肽标记开发荧光生物传感器。到目前为止，Q 体的计算设计探索很少。未来努力的一个有希望的途径是利用 MD 模拟来设计高性能Q体。据我们所知，第一项了解其淬灭机制的计算机指导研究最近才发表。本研究确定了基于纳米抗体的麦芽糖结合蛋白（Qb-MBP）和溶菌酶（Qb-Lys）Q体的关键猝灭色氨酸（图 6A）。通过 MD模拟（图 6B）的指导，本研究支持了基于纳米抗体的猝灭体的工作机制，其中直接与抗原相互作用的基于 CDR 的色氨酸是猝灭染料的最重要色氨酸。另一项计算研究调查了单链scFv 猝灭体对 Myc 肽抗原的抗原依赖性荧光反应（图 6C）。Myc肽抗原是源自 c-Myc 蛋白的肽片段，c-Myc蛋白是一种转录因子，在调节细胞增殖、生长、凋亡和分化中起关键作用。从元动力学 MD 模拟计算出的抗原与可变重链 (VH) 和轻链 (VL) 结合的自由能曲线表明，两条链在抗原存在的情况下都会结合，这似乎在结合中起着重要作用(图 6D)。模拟还表明，VH 的 N 端荧光团与关键色氨酸 (Trp103) 的相互作用最稳定(图 6E)。这为提出的实验机制提供了计算支持，其中抗原存在将色氨酸残基埋在 VH 和 VL之间，从而消除了荧光团猝灭。![]()
图6. (A) 根据 PDB ID: 5M14 建模的 MBP 结合猝灭体 (蓝色) 的拟议机制，其中 N 端共价结合的 TAMRA (绿色) 由于与内在 CDR 色氨酸 (红色球体) 相互作用而发生猝灭。与 MBP 抗原 (灰色表面模型) 结合后，TAMRA 在空间上与色氨酸 (W101、W110 和 W115) 发生遮挡，这会导致荧光强度增加。 (B) 归一化分布直方图，显示了 MBP 结合纳米抗体 (PDB ID: 5M14) 在没有抗原 (蓝色) 或存在抗原 (绿色) 的情况下从 MD 模拟得出的总 TAMRA-CDR-色氨酸距离 (W101、W110 和 W115)。 TAMRA 被认为在距离 ≤ 10 Å（阴影区）处被色氨酸猝灭。（C）VH 和 VL 系统的分子结构。图中显示了 VH（棒状）和抗原分子（红色）中的 Trp36 和 Trp103。（D）平均力势与 VH - VL 距离的关系。红色曲线对应有抗原的抗体，蓝色曲线对应没有抗原的抗体。（E）平均力势与染料罗丹明和 Trp36 之间以及罗丹明和 Trp103 之间的距离的关系。
【结论】
总之，纳米抗体研究和设计领域正在见证由计算方法和实验研究推动的显著进步。纳米抗体具有体积小、特异性高和稳定性高的特点，在诊断、治疗和生物传感等各种生物医学应用方面具有巨大的前景。通过 MD 模拟和实验研究阐明的纳米抗体的结构和功能见解为旨在增强结合亲和力、稳定性和特异性的合理设计策略铺平了道路。通过计算亲和力成熟技术，例如 MD 模拟和机器学习算法，研究人员可以迭代优化纳米抗体序列以实现所需的特性和功能。此外，包括用于结构预测、抗原对接和结合亲和力估计在内的新型计算工具和数据库的开发继续扩大可用于纳米抗体设计和分析的资源库。可以检测小分子和蛋白质的 Q 体等创新生物传感技术的出现，凸显了纳米抗体在传统抗体检测以外的各种应用中的多功能性和潜力。后者只是纳米抗体的计算设计和优化如何应用于开发改进的纳米抗体研究能力的一个例子。总之，计算方法与实验方法的结合正在彻底改变纳米抗体研究领域，使快速、精确地设计具有针对特定应用的定制特性的纳米抗体成为可能。随着计算技术的不断发展和改进，它们无疑将在加速纳米抗体在广泛生物医学和生物技术领域的开发和部署方面发挥关键作用，最终促进医疗保健和诊断学的进步。【原文出处】
El Salamouni, N.S., Cater,
J.H., Spenkelink, L.M. and Yu, H. (2024), Nanobody engineering: computational
modelling and design for biomedical and therapeutic applications. FEBS Open
Bio.
原文链接：https://doi.org/10.1002/2211-5463.13850
指导教师：王战辉
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