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大家好，上次分享了题为“抗体定向提高侧流免疫法灵敏度和选择性”，今天分享一篇发表在IJBM上类似的文章“侧流免疫分析中抗体方向的重要性”，该工作来自于江苏大学高士鹏课题组。
【摘要】
侧流免疫分析（Lateral
flow immunoassays, LFIA）因其简单、快速、成本低以及对用户和设备要求低，在即时检测领域应用广泛。然而，传统 LFIA 存在灵敏度不高和结果不准确等问题，限制了其广泛应用。氨基酸在抗体（Ab）表面的异质分布导致无法精准控制其方向，最终导致检测性能较低。为了解决这个问题，本文从固定化抗体方向调控的角度，综述了定向固定化的优良纳米探针制备，包括纳米探针类型、Ab 类型及其偶联化学成分，强调了膜上定向固定抗体的重要性，总结了抗体定向对LFIA分析性能在灵敏度、特异性、快速性、可靠性、成本效益和稳定性方面的影响，并探讨了其未来发展和挑战。【引言】
传染病（如新冠病毒）和食品安全问题日益突出，对即时检测工具的需求显著增加。LFIA 作为一种成功的即时检测设备，具有成本效益高、快速、操作简单等优点，广泛应用于生物医学、食品污染物监测和环境评估等领域。然而，传统 LFIA 存在灵敏度低、特异性差和假阴性/阳性结果等问题。为解决这些局限性，本文从固定化抗体的定向调控角度，综述了制备高性能 LFIA 的方法及其优势。在本综述中，我们旨在全面介绍在LFIA应用中定向固定化抗体（Ab）的制备及其优势。本文首先介绍了制备具有正确定向抗体的成熟纳米探针的方法（包括纳米载体、抗体及其锚定方法），随后简要讨论了在 LFIA 膜上定向偶联抗体的方案。此外，还概述了固定化抗体定向所带来的优势。最后，对抗体定向 LFIA 的挑战和趋势进行了展望。![]()
图1. 通过控制纳米探针或支架上抗体的方向来制备更好的 LFIA
【内容介绍】
1. 纳米探针上抗体的定向锚定
在LFIA应用中，信号标签的特性将在极大程度上受到两个关键组分特性的影响，即Ab与纳米载体（纳米探针）。因此，合适的纳米探针 Ab 及其偶联化学在决定 LFIA 的分析性能方面起着关键作用。就纳米探针的选择而言，金纳米粒子（AuNPs）是开发 LFIA 工具时最为广泛运用的，这得益于其强大的光学吸附能力、易于合成的特性以及在分析物识别后能够产生明显读数的优势。近期，具有独特特性的新兴纳米材料（诸如磁性、等离子体、光致发光或具备协同特性的纳米材料）为制备优质纳米标签开辟了新的途径。与此同时，强调在构建信号标签过程中涉及的连接方式同样具有关键意义，即Abs 在纳米探针上被正确标记，以确保准确识别靶标。在此方面，纳米载体上固定化抗体的取向以及表面覆盖程度，是决定抗原结合片段（Fab 片段）可及性的关键因素，进而对 LFIA 的分析性能产生影响。因此，纳米粒子-抗体（Nb-Ab）纳米结构（即纳米标签）的锚定策略应当予以有效调控，以保证所连接抗体的抗原结合区域得以充分暴露。本综述中，将仅详细探讨在纳米探针制备过程中Abs定向固定化的相关研究。
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图2. 制备免疫探针时应考虑的因素
1.1 纳米探针的特性
AuNPs 是 LFIA 中最常用的纳米材料，具有强光学吸附、易于合成和检测后信号明显等优点。直径为 20 - 40nm 的 AuNPs 常用于比色检测，因其胶体稳定性好且显色效率高；较大尺寸的 AuNPs 摩尔消光系数较高，可在一定程度上提高灵敏度，但过大则会降低灵敏度。此外，具有特殊形态的 Au 纳米材料（如 Au - SiO₂ Janus NPs、Au 纳米星、Au 纳米棒和 Au 纳米花）也被用于提高分析灵敏度，对 AuNPs 表面进行功能化可增强其胶体稳定性和抗体偶联效率。AuNPs作为信号探针在检测各种分析物方面的巨大适用性已经得到证明。但本研究涵盖的 AuNP 主要呈球形，这可能不足以实现检测复杂基质中分析物的高灵敏度和特异性。新型纳米探针正在成为展示卓越分析性能的替代方案。荧光纳米材料作为新兴的光学指示剂，具有优异的发光性能，适用于检测低丰度目标。多种类型的荧光 NPs（如时间分辨荧光微球、铕掺杂微球、量子点、上转换 NPs 和荧光团标记的纳米结构）已被探索用于提供稳定和灵敏的信号输出。其中，量子点和量子珠因其窄发射带、高荧光强度和高量子产率而成为常用的荧光探针，且量子珠辅助的荧光 LFIA 灵敏度比 AuNP 基比色法高四倍。然而，量子点存在胶体和光不稳定性的问题，通过银沉积或自组装等方法可提高其稳定性。聚苯乙烯（PS）微球作为纳米探针具有刚性强、形态均匀、物理化学稳定性好、可用于多重分析的多种颜色和高重复性等优点，其大表面积有利于结合大量抗体或负载丰富的染料 / 荧光 NPs，用于构建免疫探针或荧光 PS 探针。磁性纳米颗粒（MNPs）的独特优势是在外磁场下易于磁性回收，已被用于生物传感中的纳米吸附剂、纳米载体和信号标签。磁性 LFIA 在灵敏度、稳定性和低背景信号方面可能优于传统基于 AuNP 的 LFIA，且免疫磁分离操作可显著抑制非特异性成分的干扰，提高分析灵敏度。1.2 抗体类型
天然抗体的定向固定面临两个挑战，即Ab 表面不同氨基酸的异质分布以及不同 Abs 之间氨基酸序列和空间构象的显著差异。相比之下，工程抗体片段（如单域抗体）通过基因工程技术可确保在纳米载体上的正确取向，具有高溶解度、对极端温度和 pH 的优异物理化学稳定性、可规模化生产和高负载密度等优点，但对天然抗体组成和形态的进一步研究有助于扩大 LFIA 的应用范围。![]()
图3. 实现抗体在纳米载体上的定点固定化所面临的挑战
1.3 抗体固定化策略
在LFIA 中构建纳米探针的广泛使用策略中，直接共价固定在简便性、纳米载体-抗体缀合物的稳定性以及成本效益方面具有显著优势 。在众多共价固定方法中，碳化二亚胺化学是最被广泛接受的一种。然而，该方法不利于保持连接抗体的生物功能。仅发现一小部分（至多 4%）固定化抗体具有活性，并且当表面覆盖率增加 23.6 倍时，该百分比可能进一步降低至 0.6%。同样，吸附方法在维持抗体活性方面也较差。据报道，葡萄球菌蛋白 A（SpA）辅助固定有助于使固定化抗体的可及性保持在 91%，而物理吸附的仅为约 27%。鉴于活性抗体数量对分析灵敏度的重要性，优先选择有利于可控取向的固定方法至关重要。这对于确保 LFIA 的最佳性能和最大化抗体利用效率是必不可少的。制备位点定向纳米探针的不同策略比较已列于表1。链球菌蛋白 G（SpG）和葡萄球菌蛋白 A（SpA）是常用的配体蛋白，可选择性结合抗体的 Fc 端，使Fab 片段向外定向，广泛用于制备 LFIA 免疫探针。通过 SpA 方法固定的抗体解离常数（KD）比物理吸附法高 25 倍，表明其抗原结合率更好。除天然 SpG 和 SpA 外，重组蛋白也可用于制备标记纳米探针，可通过添加亲和标签简化偶联过程或调控其在纳米探针表面的负载密度。但是观察到较小的重组 SpG（22.4 vs 58 kDa），在纳米载体上的覆盖密度低四倍（137.5 vs 34 μg/mg NP），因此结合 Abs 的能力较低 。但是SpG 介导的方法存在两个问题，首先，抗体从纳米探针上分离，在 4 °C 下储存 5 天后，纳米探针中释放了 22% 的固定化 Ab，而共价偶联的纳米探针中仅释放了少量的 Abs ，为了解决这个问题，在 SpG 辅助结合后进行额外的交联处理可以提高生物复合物的稳定性并维持生物复合物的生物功能。其次，SpG 与 Fab 片段非特异性结合，可通过探索新型封闭剂以减少可能的干扰或应用抗IgG 抗体。
1.3.2 pH 调节
酸性和碱性氨基酸在 （Fab）2 上的异质分布将导致净电荷的巨大差异。（Fab）2在 Ab 的前部、侧部和顶部具有更高密度的带正电荷的氨基酸，在碱性条件下，（Fab）2片段带正电，而整个Ab带负电，（Fab）2 片段优选吸附在带负电荷的纳米载体上，具有“迎面”方向；在酸性 pH（如 5.0）时，Fc 区域的疏水相互作用增强，使其更易锚定。基于此，提出pH 诱导的抗体取向调控方法，如在特定 pH 下将抗体与纳米载体结合，可提高 Fab 片段的可及性，降低检测限（LOD）。该方法也适用于通过碳化二亚胺法将抗体偶联到带电纳米载体上，Parolo 等人提出了一个在羧化表面偶联 Ab 的例子，其中在 pH 5.0 下孵育有利于在共价相互作用之前定位带正电荷的 Fc 片段，导致检测限 （LOD） 比随机固定的检测限 （LOD） 降低 10 倍 。同样，pH 调节介导的方法也可用于在氨基化 NP 上偶联 Ab。pH=5.0 下的偶联导致 Fab 的静电排斥和 Fc 区的优先粘合，从而导致可接近的 Fab 片段数量相当多。![]()
图4. 通过碳二亚胺化学定向耦合 Abs 的 pH 调节方法。 Ab可以优选固定在(A)羧化或(B)胺化纳米载体上。
1.3.3 多糖链介导的定向偶联
抗体 Fc 片段的 CH₂结构域上的独特多糖部分可用于抗体的定向固定，主要有硼酸酯、高碘酸盐氧化和天然醛介导三种方法。硼酸酯法利用纳米载体表面硼酸基团与碳水化合物部分的顺式二醇之间的特异性相互作用，可简化抗体 - 纳米颗粒生物偶联物的制备过程，具有良好的通用性；高碘酸盐氧化法利用氧化多糖链产生的醛基将抗体定向偶联到胺化或酰肼衍生的载体上，但氧化处理可能影响抗体活性；天然醛介导法利用某些天然抗体 Fc 区域的醛基与酰肼修饰表面的共价结合，但该方法仅适用于一种类型的抗体，其广泛应用有待进一步验证。![]()
图5. 基于多糖链的抗体定向固定策略。 (A) 硼酸酯和顺式二醇相互作用驱动 Abs 固定在 QD 纳米载体上。(B) 将高碘酸盐氧化抗体定向固定到酰肼修饰的荧光纳米探针上，用于 C 肽检测。基于 QB（C）和 AuNP（D）的纳米探针，用于通过抗 HBsAg mAb 的 Fc 区域上的天然醛基对 Ab 进行定点偶联。
1.3.4 生物素 - 链霉亲和素相互作用
生物素 - 链霉亲和素偶联系统是一种稳定的结合对，常用于制备 LFIA 纳米探针，链霉亲和素分子上的四个高亲和力结合位点可同时负载多个生物素化抗体，实现信号放大。然而，天然抗体的生物素化会导致随机偶联，精确的位点可控生物素化仍是挑战，可通过水杨醛引导试剂或蛋白质工程方法实现位点特异性 Ab 生物素化。1.3.5 主客体相互作用
利用葫芦脲 [7] （CB [7]）与 1 - 金刚烷甲酸（ADC）之间的强结合亲和力进行超分子自组装反应，可将抗体定向偶联到上转换纳米颗粒（UCNPs）上制备荧光纳米探针，CB 促进了 Ab 的高效配体交换和超分子组装，其偶联效率是碳二亚胺偶联的 1.6-1.9 倍，制备的纳米探针适用于小分子分析物的竞争检测和致病菌（大肠杆菌 O157：H7， E. coli O157：H7）的夹心 LFIA 检测，具有良好的灵敏度和适用性。1.3.6 IgG 辅助桥联
抗 IgG 抗体可作为调节共轭抗体 Fab 可及性的替代桥接物，具有提高纳米探针表面活性抗比例和适用于其他 mAb 的通用性的特点。与 SpA 相比，抗 IgG 抗体辅助偶联所需的抗体负载量降低了 6 倍，且在检测相同浓度的 17β-雌二醇 （E2） 下观察到信号高出两倍，表明抗 IgG 抗体在节省昂贵的 mAb 成本方面具有很大的成本效益。此外，这种基于 SpA/抗 IgG Ab 的纳米探针实现了 ∼10 倍的IC50 值和 10 倍的线性范围。由于 Fc 片段在不同宿主物种中具有高度的结构保守性，可作为构建具有定向偶联抗体的纳米多功能接头进行探索。这些结果表明桥式 IgG 优于 SpA/SpG，具有高度的替代性，这可能在适应性、敏感性和成本效益方面表现出优势。此外，小鼠 IgG1-结合 Nb 被用作连接纳米载体和 mAb 的桥梁。与基于碳二亚胺法的非定向固定相比，Nb 桥接 Ab 固定化不仅表现出 1.3 倍的覆盖密度，而且每个纳米标签的可及 Fab 分数降低了 5.1 倍（Fab 可及性接近 91%）。这些结果表明 Nb 辅助固定化在控制 Ab 方向和增加 Fab 区域的可及性方面具有巨大优势。2. 抗体定向对 LFIA 性能的影响评估
抗体定向锚定对LFIA检测性能有着显著的提高，在不同靶标的灵敏检测中都展现出了优势（表2）。表2. 基于抗体定向锚定的LFIA应用
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2.1 检测限和灵敏度
定向抗体在纳米探针表面可显著提高免疫探针的免疫活性，从而增强灵敏度，使 LFIA 检测结果与超灵敏诊断设备相当。与随机偶联的纳米探针相比，定向纳米探针在所有评估浓度下均能产生更强的信号响应，适用于夹心和竞争型 LFIA。例如，通过不同的定向固定化方法制备的纳米探针，在检测人绒毛膜促性腺激素（hCG）、N - 末端前 B 型利钠肽（NT - proBNP）、乙肝表面抗原（HBsAg）等分析物时，检测限显著降低，灵敏度提高。然而，定向免疫探针并不总是能提高 LFIA 的分析灵敏度，因为纳米载体上结合的抗体数量对分析灵敏度起关键作用，而非仅仅取决于抗体的固定方法。2.2 抗干扰能力
在实际应用中，复杂的样品基质对准确检测目标物具有挑战性，而定向固定化抗体可提高纳米探针的抗干扰能力。定向探针的非特异性信号比非定向探针低四倍以上，并且在 CV 低于 10% 的情况下，观察到血清样品中 C 肽的批内和批间回收率良好（从 106.85% 到 116.40%），对 HBsAg检测定向QD探针对其他公认的生物标志物的交叉反应性可以忽略不计，并且它们在CV低于7%的血清样本中实现了可接受的回收率（从89.16%到97.63%）。此外，对纳米探针表面进行功能化处理（如聚合物修饰）或使用合适的封闭剂，可进一步提高其特异性，减少假阳性结果。2.3 LFIA 检测时间
LFIA 检测时间包括纳米探针制备时间和检测时间，多数测定时间为 10 - 30 分钟，因此纳米探针制备时间决定了 LFIA 测量的总时长。传统碳化二亚胺化学介导的非定向偶联方法步骤繁琐、耗时较长，而一些定向固定化方法如硼酸酯亲和定向抗体固定化，省略了官能团激活步骤和更短的偶联时间（5 分钟足以完成反应），可显著缩短偶联时间，提高 LFIA 测试效率。2.4 可靠性
为满足实际应用需求，定向抗体纳米探针的实用性应与标准方法进行比较。研究表明，LFIA 结果与HPLC、UPLC -
MS/MS、电感耦合等离子体质谱（ICP - MS）等标准方法以及商业分析试剂盒和芯片的结果具有良好的一致性，回收率可接受，且定向纳米探针提高的灵敏度能够准确检测痕量分析物，生物素-链霉亲和素辅助定向的纳米探针产生的结果与临床电化学发光测定（ECLA）方法的结果相当，后者的相关系数超过 98% 。如 CBP31 - BC 基 LFIA 检测 SARS - CoV - 2 病毒的结果与定量逆转录聚合酶链反应（RT - qPCR）的总准确率达 100%。2.5 纳米载体上结合和活性抗体
纳米载体上结合的抗体数量在评估固定策略对 Ab 方向的影响方面具有显着相关性。非定向探针的抗体负载密度比定向探针高 1.4 倍，同时观察到几乎相同数量的活性 Ab，表明定向探针在维持 Fab 部分的可及性方面具有巨大优势（89.1 %
vs 62.1 %）。纳米探针上定向固定化 Ab 的另一个优点是显著减少了制备最佳免疫探针的特异性 Ab 消耗。与非定向纳米探针相比，在相同甚至更高的信号强度下，定向纳米探针节省的mAb量高达66.7%，抗 IgG 抗体定向探针所需的单克隆抗体量比非定向探针低6倍以上。与碳二亚胺化学辅助的非定向固定相比，硼酸盐亲和介导的定向偶联产生了相同的荧光强度，而 Ab 负载量降低了 14 倍。同样，与非定向策略相比，酰肼基团导向的LFIA中使用的Ab量分别减少了4倍和7.5倍。每个纳米探针的mAb消耗量减少，使LFIA应用成本总体降低，这有助于显著降低每次LFIA测试的成本（21%-41%）。2.6 储存稳定性
纳米探针和基于纳米探针的 LFIA 条带的稳定性对其商业化和结果重现性至关重要。研究表明，定向纳米探针在 4°C 储存 7 天后与新鲜制备的纳米探针相比，记录的信号强度为 84.2% ，对于在氨基化 QD 上偶联的高碘酸盐氧化 Ab在储存两周后信号无明显损失，SpA 定向免疫探针在室温储存 12 个月后信号强度无明显降低。【结论与展望】
LFIA 平台具有快速、简便和成本低的优点，但仍面临灵敏度低、特异性差等问题。抗体定向调控方法可提高 LFIA 的性能，使其具备更高的灵敏度、特异性、快捷性、可靠性、成本效益和稳定性，有望推动 LFIA 成为更优异的下一代即时检测平台。然而，目前关于抗体定向调控的研究存在局限性，如当前的偶联化学方法可能影响 LFIA 的成本效益，缺乏通用的抗体定向固定方法，且在追求小型化 LFIA 系统的特殊灵敏度方面不如其他方法，在检测浓度非常不同（例如，从 pg/mL 到 ng/mL）的分析物时，需要定向 Ab 辅助 LFIA，这阻碍了它们的实际应用。未来的研究一方面可探索针对 Fc 片段保守位点的不同抗体固定策略，如利用抗体结合支架（重组 SpA 和 SpG、桥接 IgG），另一方面可将新型纳米材料作为 LFIA 信号探针比优化 Ab 偶联化学更有效地实现信号放大的潜力，以进一步提高 LFIA 的检测性能，同时利用智能手机实现数据的自动化采集、分析和可视化，促进现场快速检测。
Gao, S., Niu, L., Zhou, R., Wang, C., Zheng, X.,
Zhang, D., Huang, X., Guo, Z., & Zou, X. (2024). Significance of the
antibody orientation for the lateral flow immunoassays: A mini-review.
International Journal of Biological Macromolecules, 257, 128621.
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.128621
指导教师：王战辉
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