【摘要】
【引言】
治疗性抗体是治疗癌症和自身免疫疾病的关键药物，主要采用鼠源杂交瘤或噬菌体展示技术制备。与杂交瘤相比，噬菌体展示技术能够产生针对多种抗原的抗体，包括弱抗原或非免疫原性抗原、自身抗原、细胞表面抗原和有毒抗原，这些抗原的抗体很难通过免疫小鼠制备，并且需要的抗原用量和时间更少，在治疗性单克隆抗体的开发中越来越受欢迎。然而，使用噬菌体展示技术制备抗体缺乏“正常”的选择过程，VH-VL对会随机克隆到噬菌体展示载体上。这种选择过程未经历自然发育中的B细胞在抗原暴露之前发生的阴性选择事件，导致噬菌体展示文库中缺乏负选择。因此二者的抗体文库多样性可能存在差异。
本研究以具有多个表位的破伤风类毒素（TT）为模型抗原，比较了杂交瘤和噬菌体展示技术产生的抗体多样性。发现，杂交瘤技术产生的TT特异性抗体比噬菌体展示技术更多样化，且两者在VL和VH基因上几乎没有重叠。噬菌体展示技术产生的抗体亲和力较低，可能是由于Vk和VH基因的非同源配对。此外，测序结果表明噬菌体克隆中抗体的特异性和亲和力提高可能依赖于许多微小DNA变化的积累。
【内容介绍】
杂交瘤抗TT单抗Ig基因多样性研究
为了评估抗破伤风类毒素（TT）单克隆抗体的多样性，对21种TT特异性单抗的Vk和VH基因进行了DNA测序。
表1 V(D)J基因在抗TT杂交瘤中的应用及结合动力学
表1显示了每种抗体的V（D）J基因的使用和特异性。从7个Vk家族中分离出12个独特的Vk基因，从5个VH家族中分离出18个独特的VH基因。
杂交瘤文库在其VH-VL对上更加多样化，重叠较少。尽管某些杂交瘤使用了来自相同Vk和VH家族的基因，但这些基因通常具有不同的特异性。例如，杂交瘤18-96和7-55都使用来自VH36-60家族和Vk19家族的基因，但分别结合TT-LC和Hc两个不同表位。
并且，杂交瘤文库在识别TT表位的特异性上也更加多样化。在11个抗TT单克隆抗体中，有的特异性识别Hc片段，而3个独立的抗体特异性结合TT-LC。此外，还有1个Hc结合的单抗也特异性于TT-LC，以及3个独立的单抗特异性于TT的其他表位，在Hc和TT-LC中均未发现。
大肠杆菌噬菌体文库和扩展文库中Ig基因的多样性
由于原始未选择噬菌体展示文库的大小和多样性会影响最终抗原选择文库的多样性和特异性，因此要最大化噬菌体展示文库的大小和多样性。本研究所有杂交瘤序列均可通过VH和Vk引物成功扩增。将Vk和VH的PCR产物直接克隆到pCES中，扩增噬菌体文库后，对随机选择的克隆进行v基因序列分析，发现存在多个Vk和VH基因家族。从扩增文库中分离到的VH基因来自BALB/c小鼠中最常用的5个VH家族。Vk序列既有胚系突变，也有超突变，代表了高使用率和低使用率家族。例如，Vk1、Vk4/5和Vk19在成年BALB/c小鼠中的使用率约为20%。Vk2，Vk12和Vk23很少使用，但在扩展的库中可以检测到。
总体而言，本研究构建的噬菌体文库覆盖了BALB/c小鼠中大多数常用的Vk和VH家族，未检测到的家族在小鼠中的利用程度较低，表明该策略有效增加了文库多样性。
Fab在大肠杆菌噬菌体文库中的表达
噬菌体文库的多样性可能由于噬菌体外壳蛋白pIII融合的Fab在大肠杆菌中的折叠效率低下以及Fab对大肠杆菌的潜在毒性而受到限制。
首先用未选择的噬菌体感染SS320大肠杆菌，并诱导表达Fab片段。用ELISA检测Fab的表达，发现只有9%的菌落能够成功表达Fab。比较了能够分泌Fab的VH/Vk序列与不能分泌Fab但含有VH和Vk插入的克隆，并未发现VH/Vk基因使用上的明显差异。其次，从pCES未扩增库存库中的172个独立克隆中小规模地释放噬菌体。抗Fab ELISA结果表明，60%的克隆产生了携带噬菌体的Fab，这与文库中已知含有VH和Vk序列的克隆的百分比一致。
在包含重链插入和轻链插入的未选择文库中，大多数克隆都能够表达携带噬菌体的Fab，并且改变选择条件并没有提高从噬菌体展示文库中分离的抗原特异性克隆的遗传多样性。因此，抗TT的Fab片段的多样性有限并不仅仅是由于噬菌体展示文库的多样性不足所导致的。
抗原选择噬菌体展示文库的Ig基因多样性
有研究表明，在构建噬菌体展示库的过程中，选择步骤倾向于筛选出强抗原结合物，而扩增步骤则偏向于快速生长的克隆。这种多轮的选择和扩增过程通过淘汰结合能力弱和生长缓慢的克隆，可能会减少最终库的遗传多样性。
为了探索不同选择参数对噬菌体文库多样性和功能的影响，采用了单独的TT-LC和Hc进行选择，以期在淘选后获得更多样化的TT阳性克隆。结果发现，不同的选择条件有助于增加TT反应性克隆的多样性和比例（表2）。从第五轮淘选后，无论是从TT还是Hc输出的噬菌体池中筛选出的噬菌体克隆，大约有13%显示出了抗原特异性。这表明，通过优化淘选条件，可以在一定程度上提高噬菌体展示文库中抗原特异性克隆的多样性和数量（图1、表3）。
表2 选择参数
为了探究重复选择和扩增是否导致遗传多样性的减少，对噬菌体展示的前几轮选择池进行了筛选，并对抗原特异性克隆的Vk和VH基因进行了测序分析。结果显示，在噬菌体展示文库中，Vk基因的使用主要集中于Vk4、Vk9和Vk19家族，VH基因的使用涉及6个不同的家族，并与6个不同的DH和3个不同的JH基因重组，共发现52个独特的VDJ序列（图2、表3）。尽管早期噬菌体池中抗原特异性克隆的比例较低，但其V基因的多样性与后期噬菌体池中的克隆相似，这一发现表明，多轮的选择和扩增步骤可能并不是导致TT特异性噬菌体克隆遗传多样性减少的主要因素（表3）。
表3 Vk和VH克隆型配对的发生率
图1 VL克隆型的代表性IgAT分析
图2 VH克隆型的代表性IgAT分析
抗TT杂交瘤文库与噬菌体展示文库的比较
对噬菌体展示技术获得的抗TT抗体库和杂交瘤技术获得的抗体库进行比较分析，结果发现两者仅有3个相同的VH-Vk配对。此外，虽然两个文库都使用了kf4/Jk4轻链基因，但它们与不同的VDJ序列配对。在两个文库中，共有7个VH基因被使用，但它们的VDJ组合不同，且杂交瘤中的H链没有与噬菌体克隆中的L链配对。从噬菌体展示文库中分离的TT特异性克隆的V基因库仅限于4个Vk和16个VH基因。与杂交瘤文库相比，Vk的多样性相当有限（图3&4）。
图3 杂交瘤P4T29115与噬菌体展示分离物S917的VL (A)和VH (B)基因序列比对。
先前研究表明，保留原始配对的抗TT文库能够产生多样化的V基因库，而同一供体的组合文库则显示出较低的多样性。尽管噬菌体文库理论上应该包含丰富的针对特定抗原的特异性序列，但实际上观察到的遗传多样性有限，这可能是由于抗体轻链（Vk）和重链（VH）基因在形成过程中的随机配对导致的。
然而，在噬菌体文库中大多数VH和Vk基因存在多个超突变变体。这些超突变变体的存在揭示了体内亲和成熟的过程通常与二次免疫反应相关。大多数突变集中在互补决定区（CDR），尤其是CDR3。CDR3区域的多样性对于抗体的亲和力和特异性至关重要，CDR3中不同氨基酸残基的存在可能源于抗体基因重排过程中的重组机制，但也可能是亲和成熟过程中突变的结果。
抗TT单抗与单克隆抗体的结合动力学
为了比较TT特异性单克隆抗体和Fab的速率和解离常数，利用表面等离子体共振（SPR）测定了所有单克隆抗体和噬菌体展示文库中代表性Fab的结合动力学。
总体而言，与单克隆抗体相比，Fab片段的亲和力较低，其解离常数（KD）中位数为9.06×10-9 M，而单克隆抗体的KD值中位数为3.46×10-9 M。此外，Fab片段的结合速率常数（ka）中位数为5.76×10-4 Ms，低于单克隆抗体的9.4×10-4 Ms，但两者的解离速率常数（kd）没有显著差异（图5）。
图5 杂交瘤和噬菌体展示文库的TT特异性单抗的结合动力学
【结论】
通过比较来自单一TT免疫小鼠的B细胞产生的杂交瘤和噬菌体展示库，杂交瘤库在VH-VL配对和TT表位特异性上呈现更高的多样性，杂交瘤源的单克隆抗体对TT的亲和力更高。这种差异可能源于杂交瘤技术在早期B细胞克隆的稳定性、抗体产生效率以及细胞发育方面的优势，以及噬菌体展示技术可能存在表面展示效率低和宿主细胞毒性的限制。
【原文出处】
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