摘要：本文报道了使用噬菌体展示技术从人天然库、兔免疫库中鉴定、改造并表征了玉米赤霉烯酮（ZEN）的重组单链可变片段（scFv）抗体的研究工作。ZEN是一种具有雌激素活性的霉菌毒素，本研究筛选出一株特异性识别游离ZEN的噬菌体展示scFv克隆，命名为yZEN2A8。编码yZEN2A8 scFv的基因被亚克隆到pET-21d(+)和pKP300 delta III载体中，以产生重组scFv和scFv-碱性磷酸酶（AP）抗体。经过ELISA优化后，重组yZEN2A8 scFv抗体和scFv-AP融合蛋白的灵敏度分别提高了约2倍和60倍。竞争性ELISA表明，优化后的重组yZEN2A8 scFv抗体和scFv-AP融合蛋白的半抑制浓度（IC50）分别为90和14 ng/mL，检测限（LOD）分别为20和2 ng/mL，并且没有观察到与其他常见霉菌毒素的交叉反应。同源模建显示了重组抗体对ZEN的特异性结合，并展示了重链和轻链的互补决定区（CDRs）在抗体—抗原相互作用中的作用。本研究首次应用scFv-AP形式抗体检测玉米和小麦样品中的ZEN污染，这种抗体可以作为开发用于检测ZEN污染的便捷试剂，包括基于生物传感器的形式的原型。
研究背景
玉米赤霉烯酮（ZEN）是由镰刀菌属真菌产生的非甾体雌激素性霉菌毒素，不溶于水且耐热，并在受污染的谷物制品中稳定存在。ZEN被归类为第三类致癌物，可能导致生殖系统问题和动物雌激素过多症状。因此，开发一种敏感且便捷的ZEN检测方法对保障食品安全至关重要。目前有几种用于分析ZEN的方法，例如高效液相色谱法（HPLC）、薄层色谱法（TLC）、液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）和免疫分析法等，其中免疫分析法以其快速简便的特点受到青睐。传统上，霉菌毒素或半抗原特异性抗体是从免疫动物或杂交瘤细胞系中产生的。然而，多克隆抗体的供应有限且批次间存在差异，而单克隆抗体的生产则技术要求高且有时不够直接。相比之下，重组抗体因生产成本低且易于集成到生物传感器平台，显示出替代传统方法的潜力。尽管已有抗ZEN重组抗体的报道，但目前市场上尚未出现基于重组抗体的ZEN商用检测试剂盒，这凸显了开发此类新型检测工具的重要性。
本研究首次从人源噬菌体展示抗体文库（Yamo I）中分离、表达和鉴定了抗ZEN的重组单链抗体（scFv），并将其克隆到表达载体中，在E. coli B株中以可溶性scFv和碱性磷酸酶（AP）融合蛋白（scFv-AP）形式表达。评估了不同形式重组抗体的结合特性，最终通过小麦、玉米样品的确证分析表明，该单链抗体对食品和饲料原料中ZEN污染的检测具有实际意义。
研究内容
1. 从噬菌体展示库中淘选抗ZEN抗体
在没有切换（方法Ⅰ）和切换（方法Ⅱ）结合蛋白的情况下，使用非免疫人噬菌体展示scFv库Yamo I 和免疫兔噬菌体展示scFv库BozMixI.2，针对ZEN进行生物活性淘选，淘选结果分别显示在表1和表2中，每轮筛选后对ZEN特异性噬菌体进行富集，方法II能观察到从每轮获得的噬菌体克隆数量和阳性噬菌体克隆数量有所增加。
表1 非免疫人抗体库（YAMO I）的筛选结果
表2 免疫兔抗体库（BozMixI.2）的筛选结果
通过噬菌体ELISA对从两个文库中筛选出的噬菌体克隆与偶联了不同蛋白质（即 BSA、OVA 和 KLH）的ZEN的结合情况进行了确认，如图1所示。最终，从免疫兔文库中分离到2个阳性噬菌体克隆，从未免疫的人源scFv文库中分离到8个阳性克隆。
图1 兔源和人源噬菌体展示scFv抗体与ZEN的结合特性
2. 表征来自E. coli HB2151的可溶性scFv
为了确认游离scFv抗体的结合，使用上述10个噬菌体克隆感染E. coli HB2151，在E. coli HB2151的非抑制菌株中，噬菌体外壳蛋白gIII与scFv基因之间的琥珀终止密码子被识别为终止密码子，因此产生与6xHis和Myc标签融合的可溶性scFv并分泌到培养上清液中。ELISA结果表明，仅从人类文库中分离的scFv克隆YA8、YB1和HYH10可以与ZEN偶联蛋白特异性结合（图2），而兔文库中的scFv克隆均无法识别靶标。该结果与生物淘选结果均表明，兔scFv很难获得。
图2 兔和人的可溶性scFv与ZEN的结合特性
3. scFv克隆的氨基酸序列分析和分子对接
研究人员对scFv克隆YA8、YB1和HYH10进行DNA序列分析，结果显示三者氨基酸序列相同，如图3D所示，并将该scFv重命名为yZEN2A8。yZEN2A8氨基酸序列分析表明，其含有来自胚系V5-51*01的家族5的可变重链（VH）和来自胚系V1-44*01的λ家族的可变轻链（VL）。
为了进一步了解这种scFv抗体的性质，研究人员基于模板生成了其与配体3D结构的同源模型（图3），该单链抗体含有15个氨基酸的长肽（GGGGS）3，连接VH和VL结构域，由环状连接的反平行折叠的β片层组成，显示了免疫球蛋白可变区的折叠特征。重链和轻链的CDR都参与抗体-抗原相互作用，形成有利的结合表面，如图3A-C所示。该scFv与ZEN形成两个氢键，一个位于ZEN的羧基与CDRH3的Arg103之间，另一个位于ZEN的另一个羧基与CDRL3的Lys175之间；此外，还观察到CDRH3的Val111和CDRL3的Trp235的疏水相互作用。在yZEN2A8 scFv的结合口袋中，一个深腔与半抗原ZEN具有很强的互补性（图3C）。上述结果表明，yZEN2A8 scFv抗体能够形成合适的空腔来嵌入整个ZEN分子，并且可以通过氢键和疏水相互作用形成稳态复合物，该结果对于通过定点突变、链间重排和噬菌体展示技术的组合来进一步改善抗体特性很有价值。
图3 yZEN2A8 scFv与ZEN的分子对接模型以及抗体和半抗原相互作用
4. 制备并鉴定抗ZEN的scFv和scFv-AP
使用E. coli HB2151表达编码6xHis标记scFv的pET-21D (+)/yZEN2A8质粒，该质粒通过在细菌染色体上组成性表达二硫键异构酶DsbC以及trxB/gor突变来促进细胞质中的二硫键形成，而细胞质DsbC也可以作为伴侣，帮助不需要形成二硫键的蛋白质折叠。为了获得结合性能更好的scFv，研究人员通过竞争性ELISA预测了yZEN2A8 scFv的二硫键形成和正确折叠（图4红线和绿线）。此外，还制备了scFv的碱性磷酸酶（AP）融合蛋白（yZEN2A8 scFv-AP），有研究表明scFv-AP对半抗原的结合敏感性高于游离scFv形式的结合敏感性，因此该蛋白可以用作一步法竞争性ELISA中的检测探针（图4蓝线）。
图4 yZEN2A8 scFv和scFv-AP与ZEN-KLH的竞争性ELISA
5. ELISA优化
为了提高重组抗体对ZEN的结合性能，研究人员首先通过棋盘滴定优化了ELISA的条件，以获得竞争性ELISA的最佳靶标和抗体浓度，表3总结了使用各种ZEN偶联物时对scFv和scFv-AP的优化条件。随后，研究人员使用每个固定化目标的最佳条件再次进行竞争性ELISA（图5），ELISA优化前后的IC50值总结如表4所示。与ZEN-BSA和ZEN-KLH相比，OVA偶联物是固定的最佳靶标。使用ZEN-OVA包被时，YZEN2A8 scFv抗体和scFv-AP融合蛋白的IC50值分别为90和14 ng/mL，检出限分别为20和2 ng/mL。与ELISA优化前相比，yZEN2A8scFv和scFv-AP的灵敏度分别提高了2~60倍。该结果进一步证实了scFv的碱性磷酸酶融合蛋白（scFv-AP）在通过竞争性ELISA检测半抗原时更有效。
表3 棋盘滴定中ZEN-偶联蛋白和scFv/scFv-AP的最佳浓度
图5 优化后的竞争性ELISA
表4 ELISA优化前后克隆yZEN2A8 scFv和scFv-AP的IC50值
6. ScFv-AP融合蛋白的交叉反应性
研究人员在没有优化ELISA的情况下，以不同浓度的游离毒素黄曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素A（OTA A）、伏马菌素（FUM）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）为竞争对手，用竞争ELISA检测本研究中鉴定的抗ZEN抗体yZEN2A8 scFv-AP的结合特异性，结果显示（图6），YZEN2A8 scFv-AP融合蛋白与ZEN-KLH的结合仅随ZEN浓度的增加而降低，而不受AFF1、OTA、FUM和DON浓度的影响。该研究表明重组 yZEN2A8 scFv-AP可用于检测ZEN，且特异性较高。
图6 交叉反应性测定
7. 确证分析
为确认重组yZEN2A8 scFv和scFv-AP在真实样品中分析ZEN污染的适用性，研究人员使用玉米和小麦标准物质进行了两种类型的实验。第一个是空白添加试，第二个是定性分析试验。在空白添加试验中，研究员向空白样品提取物中添加一系列浓度的ZEN，分别用scFv或scFv-AP测定IC50，结果见表5；在定性分析试验中，研究员通过ELISA信号的降低对毒素进行定性检测，结果见表6。
表5 用yZEN2A8 scFv和scFv-AP检测添加玉米和小麦提取物的竞争ELISA结果
表6 采用各种提取方法对污染样品进行竞争ELISA，并使用scFv或scFv-AP进行检测
结论
该研究成功利用噬菌体展示技术生成了用于检测ZEN的重组抗体原型yZEN2A8 scFv，以及该单链抗体与碱性磷酸酶的融合蛋白scFv-AP。
该重组抗体可作为进一步改进的基础，改进方案包括：
提高抗体亲和力；
增强抗体在高温潮湿环境下的稳定性；
优化提取方案；
优化大规模生产工艺；
进一步工程化以便与生物传感器结合或转换为适用于侧向流动检测的结构。
优化后的重组抗体不仅能实现毒素污染的定量测量，还能用于开发快速简便的检测工具或即时诊断设备，适用于食品、饲料及农产品的现场检测。该团队首次报道人源噬菌体展示抗体库生成的scFv-AP格式重组抗体，并证实了其在ZEN检测中的高效性。此外，该抗体来源于人，或许在治疗毒素急性中毒中有一定的应用价值。
原文出处
Sompunga P , Pruksametanan N , Rangnoi K , et al. Generation of human and rabbit recombinant antibodies for the detection of Zearalenone by phage display antibody technology[J]. Talanta, 2019.
指导老师：王战辉
