Food Chem X：高效催化活性的抗生素- Fe3O4 纳米颗粒增强化学发光检测食品中四环素残留

摘要：四环素(TCs)是全世界畜牧业生产中最常用的抗微生物药物。食品中四环素类残留监测对环境和食品安全具有重要意义。本研究建立了一种无标记化学发光(CL)方法。Fe₃O₄ NPs（四氧化三铁纳米颗粒）是一种磁性材料，在CL试验中作为催化剂，促进鲁米诺与过氧化氢（H₂O₂）之间的相互作用。TCs可以增强Fe₃O₄ NPs的催化能力，并导致CL强度进一步放大。CL强度随四环素(TCs)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)浓度呈线性变；TC的检出限为4 nmol/L, OTC的检出限为6 nmol/L, CTC的检出限为2 nmol/L。本研究成功应用于牛奶、鸡蛋和蜂蜜样品中三种TCs残留的检测。

【引语】

     TCs因其低成本和广谱抗菌活性而成为畜牧业中最常用的抗菌药物。食物中的TCs残留可能对人类健康产生重大影响，如消化系统疾病、肾脏和肝脏损伤和骨骼生长抑制。传统的仪器测定方法具有特异、灵敏和准确的优势，但仪器昂贵、操作复杂、耗时长，不适合现场快速检测。因此，快速现场分析、高通量和即时检测仍然是当前研究的重点。

  化学发光(CL)传感技术因其灵敏、高通量和实时的特点，已广泛应用于食品中药物残留的检测。纳米酶因其稳定性高、酶活性可调、结构多样、制备方法多样、价格低廉、易于储存等优点而迅速发展，成为天然酶的有力替代品。近年来，利用各种纳米酶代替天然酶用于催化CL体系实现信号放大，进一步提高了CL的稳定性，扩大了应用范围，降低了成本。Fe₃O₄纳米颗粒(MNPs)是第一个被报道的纳米酶，因其固有的过氧化物酶样活性，已广泛应用于制药、催化治疗、环境治理和生物传感等领域。TCs具有与金属离子如Fe³⁺、Fe²⁺结合的强烈倾向，形成的Fe-TC配合物可以在溶解氧存在的情况下产生活性氧（ROS），主要是羟基自由基（·OH）。因此，MNPs近年来已被广泛用于TCs的吸附和去除。

  本文建立了一种不含抗体的无标记CL传感器，用于检测TCs。MNPs不仅可以作为纳米酶催化化学发光反应，而且还具有作为吸附剂的潜力。TCs可以增强MNPs的过氧化物酶催化能力。化学发光策略可以显著提高灵敏度，有效降低检测结果的假阳性率。该工作已成功应用于实际样品(牛奶、鸡蛋和蜂蜜)中TC、OTC和CTC的残留检测，在食品安全和卫生管理中具有潜在的应用前景。

【内容介绍】

1、Fe₃O₄ NPs的合成与表征

     Fe₃O₄ NPs是通过经典的溶剂热方法合成的。将0.5290 g无水FeCl₃溶解于25mL乙二醇中，剧烈搅拌，得到清澈透明的溶液，在混合溶液中加入2.2582 g无水NaAc，继续搅拌30分钟。随后，将溶液转移到50ml的聚四氟乙烯内衬高压灭菌器中。高压灭菌器在200℃下加热8小时，自然冷却至室温。用无水乙醇和蒸馏水洗涤三次后，用外磁场收集黑色产物。最后，冷冻干燥过夜，保存在4℃，得到的Fe₃O₄ NPs分散在HAc-NaAc缓冲溶液中。

  用TEM表征了Fe₃O₄ NPs的形貌和直径。从图1A和图1B中可以看出，Fe₃O₄ 纳米粒子接近球形，平均直径约为250-300 nm。利用FTIR和XPS表征了Fe₃O₄ NPs的元素组成和化学结构。在 Fe 2p 的XPS光谱中(图1C)，710和725 eV的峰分别对应于Fe 2p_1/2和Fe 2p_3/2。O1的结合能约为530 eV(图1D)。FI-IR光谱如图1E所示，在576.65 cm⁻¹处有一个吸收峰，这是Fe-O键的特征。以上表征都能证明Fe₃O₄ NPs的成功合成。

图1所示。Fe₃O₄ NPs的表征。TEM图像(A、B)；XPS光谱(C和D)和FT-IR光谱(E)。

2、TCs测定的传感机制

     Fe₃O₄ NPs具有类过氧化物酶活性，通过Fenton反应催化H₂O₂分解产生·OH自由基，·OH能够氧化鲁米诺产生发光。TCs可以加速Fe₃O₄ NPs中电子的转移，从而增强过氧化物酶的催化能力。通过TCs的络合，Fe₃O₄ NPs表现出优异的催化性能，导致CL强度增强。

图2所示。基于Fe₃O₄ NPs酶样活性的TCs检测原理。

3、用CL法检测TC的可行性

  本文研究了有无TCs存在时，鲁米诺–H₂O₂–Fe₃O₄ NPs的CL光谱和动力学曲线(如图3A和3B所示)。鲁米诺–H₂O₂–Fe₃O₄ NPs-TCs的最大发射波长仍在425 nm附近，与鲁米诺–H₂O₂体系相同。CL强度在反应开始时达到最大值，随后开始迅速减弱，1 min后衰减至相对稳定状态。说明Fe₃O₄ NPs和TCs作为助催化剂，在不改变反应机理的情况下增强了鲁米诺–H₂O₂体系CL强度。这些都证实了该增强CL系统可以成功应用于TCs的检测。

  为了验证该方法的可行性，以CTC为目标设计了四组实验，每组包括样本试验(含CTC)和空白试验(不含CTC)，样品检测和空白检测的CL强度同时被测量。苯基苯酚（BIP）通过提高羟基自由基的稳定性来延长CL时间，增强CL强度。如图3C所示，第二组和第三组的CL强度大于第一组和第四组，这表明在Fe3O4 NPs存在下，鲁米诺–H₂O₂体系的CL强度因其酶样活性而增强。催化能力排序为: BIP=BIP-CTC < Fe₃O₄ NPs < Fe₃O₄ NPs-CTC < Fe₃O₄ NPs-CTC-BIP. 增强的CL是由于Fe₃O₄ NPs与CTC的络合作用。

图3所示。CL分析的可行性。

4、试验条件优化

  本文对Fe₃O₄ NPs浓度、H₂O₂浓度、鲁米诺浓度和不同pH缓冲液4个关键参数进行了优化。同时测定各组样本试验(RLU)和空白试验(RLU₀)的CL强度。如图4所示，随着Fe₃O₄ NPs浓度的增加，CL强度的变化始增大，在1.2 mg/mL时达到最大值。因此，后续研究采用1.2 mg/ mL的Fe₃O₄ NPs。同样，H₂O₂和鲁米诺的浓度分别优化为20 mmol/L和3 mmol/L(图5和图6)。如图7所示，在pH为9.0时CL强度最大，说明Fe3O4 NPs在碱性条件下可表现出较高的催化活性。

图4所示。Fe₃O₄ NPs浓度的优化。

图5所示。H₂O₂浓度的优化。

图6所示。鲁米诺浓度的优化。

图7所示。缓冲液pH的优化。

5、CL法的分析性能

  在最佳条件下，使用该方法测量了不同浓度TC的化学发光强度。如图8所示，OTC浓度与ΔRLU（相对发光单位变化）在10–2800 nmol/L的范围内呈现出线性关系，线性回归方程为ΔRLU = 8.483c + 12046 (R² = 0.9851)，检测限（LOD）为6nmol/L。TC浓度与ΔRLU在10-2400 nmol/L的范围内呈现出良好的线性相关，线性回归方程为 ΔRLU = 13.358c + 4441（R² = 0.988），LOD为4nmol/L。CTC浓度与ΔRLU在5-2100nmol/L的范围内呈现出良好的线性相关，线性回归方程为ΔRLU = 12.089c + 6638（R² = 0.9819），LOD为2nmol/L。与其他方法相比(表1)，该传感策略的LOD相对较低，检测范围较宽，优于文献中报道的大多数方法以及我们自行开发的HPLC方法进行验证。

图8所示。ΔRLU强度与不同tc浓度呈线性关系。(A代表CTC；B代表TC；C代表OTC)

表1：不同测定方法的比较。

6、TCs的选择性

  为了评估所提出的CL方法的选择性，进行了几种常见干扰物的测试，如抗生素、分子和离子。如图9所示，只有三种四环素类抗生素（TCs）能导致CL强度显著增强。其他干扰物质对CL强度没有影响，说明该方法对TCs检测具有较好的特异性。

图9所示。CL法的选择性，n = 3。

7、真实样本分析

  本研究对牛奶、鸡蛋和蜂蜜中的TCs进行检测。如表2所示，回收率为92.9% ~ 110.0%(牛奶)、92.9% ~ 110.0%(鸡蛋)和92.9% ~ 104.2%(蜂蜜)，均优于HPLC法。相对标准偏差（RSD）为4.8% ~9.0%(牛奶)，4.1%~8.2%(鸡蛋)和5.1%~8.8%(蜂蜜)。上述结果表明，本方法可用于牛奶、鸡蛋和蜂蜜中TCs的检测。

表2：CL法和HPLC法在实际样品中的回收率和相对标准偏差。

【结论】

  本研究建立了一种利用Fe₃O₄ NPs的酶样活性检测TCs的高灵敏度和简单的CL方法，该方法具有三个优点：第一，本研究所提出的传感策略对抗生素TCs家族具有广泛的特异性，适合检测TCs残留的总和；第二，CL传感器不需要生物受体，反应时间短至30 s，在实际应用中对TCs的现场筛选具有显著优势；第三，本研究中提出的传感器在检测到TCs时信号增强能够有效降低检测结果的假阳性率。本研究为TCs检测提供了一种新的广谱传感策略，为现场快速筛选TCs残留提供了一种可行的选择。

原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC11137521/pdf/main.pdf