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【摘要】
采用传统的IgG抗体作为识别元件时，氟喹诺酮类药物（FQs）免疫分析检测方法的特异性和灵敏度往往较低。本研究采用鲨鱼源单域抗体(ssdAbs)作为新的识别元件，提高了诺氟沙星（NOR）免疫分析检测方法的灵敏度和特异性。利用噬菌体展示技术成功分离出5个NOR特异性克隆，并构建可溶性表达体系生成ssdAbs，其中1N9
ssdAb对NOR完全抗原的亲和力最好，检出限为0.392
ng/mL，交叉反应率小于8.240 %，表明其具有较高的灵敏度和特异性，是一种新的NOR检测识别元件。ELISA结果显示，在NOR阴性的鱼基质中未观察到严重基质干扰，1N9
ssdAb仍然可以有效地识别完全抗原NOR。icELISA结果显示1N9
ssdAb能检测10 ~ 1000 ng/mL范围内的NOR，回收率在93.66%
~ 116.49%之间，重现性较好。本研究为NOR检测提供了一种新的有效识别元件。【引言】
NOR是典型的第三代氟喹诺酮类抗生素之一，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较高的抑菌活性。目前，NOR已广泛应用于哺乳动物胃肠道、泌尿系统和呼吸道传染病的治疗。已有研究证实NOR的滥用可能导致其在环境中积累，并逐渐威胁生态系统和人类健康。因此，迫切需要开发快速可靠的NOR检测方法。现有的NOR检测方法如高效液相色谱-台式四极轨道阱混合质谱法、毛细管电泳法、荧光法等，虽灵敏度和准确性较好，但通常需要复杂的前处理、繁琐的制备程序、大量的试剂或昂贵的仪器。免疫分析法因其快速、简便、适用于大量筛选而成为一种新兴的小分子检测方法。但兔或小鼠IgG抗体用于FQ检测时，交叉反应率可达90%，这表明传统抗体材料不足以实现FQ的准确检测。用其他新的识别元件取代IgG抗体有望解决这一难题。鲨鱼血清含有350
mmol/L尿素，渗透性盐离子浓度很高。因此，具有更多疏水核心构象和更短α-螺旋结构的鲨鱼抗体 (IgNAR)在极端内部环境下应该具有更强的稳定性，ssdAbs也应该具有更高的稳定性和溶解性。然而，由于鲨鱼饲养和免疫的困难，利用ssdAbs作为识别元件的小分子检测相关研究很少。聚乙烯亚胺（PEI）是一种有效的半抗原载体，可以显著提高靶向小分子的生物筛选效率。本研究采用碳二亚胺法将NOR与PEI偶联，并在生物筛选过程中使用复合物NOR-PEI作为包被原。经噬菌体展示技术分离、异种表达和验证，在众多克隆中筛选出具有最佳结合能力的NOR特异性克隆1N9。此外，还研究了1N9 ssdAb在3种鱼类基质中的性能。本研究为水产养殖中NOR的免疫检测方法提供了一种新的有效识别元件。【主要内容】
1.NOR特异性ssdAbs的表征
在本研究中，经过三轮NOR特异性生物筛选，分离并鉴定出29个NOR特异性克隆。选择与NOR结合能力相对较高的NOR特异性VNAR基因1N2、1N9、2N43、2N51和2N65进行进一步实验。这些克隆的氨基酸序列比对结果如图1所示。![]()
图1.NOR特异性克隆氨基酸序列比对结果
SUMO融合表达系统可使所表达的融合蛋白具有更高的稳定性和溶解度。因此，为实现目标基因VNAR的可溶性表达，本研究选择pET28a-SUMO质粒作为表达载体。图2分别为pET28a-SUMO-1N2、pET28a-SUMO-1N9、pET28a-SUMO-2N43、pET28a-SUMO-2N51和pET28a-SUMO-2N65质粒在卡那霉素固体板上转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌落的生长情况。由于重组质粒中含有卡那霉素耐药基因，因此成功生长的菌落可视为转化成功。收集菌落用于后续的异源表达实验。![]()
图2. 重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)在卡那霉素固体板上的生长情况
破碎菌体并离心，收集上清液进行蛋白纯化。结合缓冲液洗涤后，分别用20、50、100、200和500 mM咪唑洗脱靶蛋白，所有洗脱液经12% SDS-PAGE鉴定。融合蛋白的理论分子量约为33.8 ~ 35.8 kDa，分别由1N2 (12.1 kDa)、1N9 (12.3 kDa)、2N43 (12.7 kDa)、2N51 (12.9 kDa)、2N65 (14.1 kDa)和SUMO标签蛋白(21.7 kDa)组成。从图3可以看出，所有选择的NOR特异性VNAR基因都显示了相应分子量正确的靶带，用红框标记，并总结在表1中，表明所有选择的NOR特异性VNAR基因都在pET28a-SUMO表达系统中实现了可溶性表达。![]()
图3. 1N2-SUMO、1N9-SUMO、2N43-SUMO、2N51-SUMO、2N65-SUMO不同咪唑洗脱液的SDS-PAGE鉴定结果，其中M波段为蛋白标记(180 kDa)， 1-5波段分别为20、50、100、200、500 mM咪唑洗脱成分
表1. 含有融合蛋白的咪唑浓度
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收集含有目标融合蛋白的洗脱液，并进行透析以供进一步使用。利用Ulp蛋白酶消化系统，分离ssdAbs和SUMO标签蛋白，洗脱液的SDS-PAGE结果如图4所示。可以看到，代表融合蛋白的靶带(约35 kDa)在消化后几乎消失。新条带的分子量为10 kDa ~ 15 kDa，与所有酶解体系洗脱液中1N2、1N9、2N43、2N51和2N65 (12.1-14.1 kDa)的理论分子量相匹配，表明ssdAbs成功地从融合蛋白中分离出来。根据蛋白浓度计算结果，ssdAb的产率均远高于此前报道的分子伴侣共表达的产率。如图5所示，所有NOR特异性ssdAbs与NOR- PEI的结合均呈浓度依赖关系。在这些NOR特异性ssdAb中，1N9 ssdAb对NOR的结合能力最强。![]()
图4.洗脱液SDS-PAGE鉴定结果
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图5. NOR特异性ssdAbs对NOR-PEI的ELISA结果2.NOR特异性ssdAbs灵敏度试验
所有NOR特异性ssdAbs的icELISA结果如图6所示。结果表明，1N9 ssdAb在所有NOR特异性克隆中表现出最好的靶标结合能力。与其他类型的抗体识别元件相比，1N9 ssdAb检测NOR的IC50值略优于以往传统的IgG抗体，对靶标NOR的识别能力与IgG抗体相当甚至更好，与IgY抗体相比更强。在抗体灵敏度方面，1N9 ssdAb已达到水产养殖中NOR的检测要求。由于1N9 ssdAb对NOR的结合能力最好，因此进一步研究其在鱼基质检测中的特异性和性能。图6. NOR特异性ssdAbs的icELISA结果
3. 1N9 ssdAb特异性测定
由表2可以看出，1N9 ssdAb与其他FQs的CR值较低(< 8.240%)，说明1N9 ssdAb形成的抗体结合簇较少识别其他FQs结构。因此，在抗体特异性方面，1N9 ssdAb可以满足水产养殖中NOR的检测要求。表2.1N9 ssdAb与其他FQs的交叉反应情况
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4.鱼基质中1N9 ssdAb的ELISA分析
目前对NOR免疫分析检测中基质干扰的研究比较少见。然而，抗体在实际食物基质中的性能至关重要。已有研究表明，动物源性食品中的成分可能会对免疫检测产生严重干扰，矩阵指数(Im)可达50%。本研究在三种鱼基质中均未观察到严重的基质干扰。如图7所示，虽然不同NOR阴性鱼基质中的吸收值与PBS基质中的吸收值有显著差异，但三种NOR阴性鱼基质中的Im值均小于8.69%，说明1N9 ssdAb在对NOR的识别过程中没有受到基质干扰。图7. ELISA验证1N9ssdAb在NOR阴性鱼基质中的OD450和Im(%)
由表3可以看出，在icELISA测定中，当NOR添加浓度分别为10、100和1000 ng/mL时，大菱鲆、大黄鱼和花鲈鱼基质中的回收率无显著差异，所有CV值均小于9.92%。结果表明基于1N9 ssdAb的NOR检测方法具有良好的稳定性和重现性。为了进一步验证icELISA的准确性，采用高效液相色谱法（HPLC）对NOR阴性鱼基质和NOR阳性鱼基质进行了NOR浓度的测定。如表3所示，不同的NOR加标浓度下，三种鱼基质的回收率同样无显著差异。所有RSD值均小于 9.67%。表4总结了不同食物基质中不同方法的NOR检测结果，本研究的LOD、检测方法、回收率(%)和RSD/CV(%)与以往报道相当或更好。综上所述，1N9 ssdAb可作为鱼基质中NOR免疫分析方法的识别元件，有望替代传统的NOR快速免疫层析试纸上的IgG抗体在水产养殖中进行大量筛选和现场抽样检测。表3. 采用ELISA和HPLC测定NOR阳性、阴性鱼基质中NOR浓度、回收率和CV值结果
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表4. 不同方法在NOR食品基质检测中的性能比较
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【结论】
本研究利用噬菌体展示技术成功分离出5个NOR特异性克隆，通过构建SUMO表达系统和Ulp蛋白酶消化系统，在众多的NOR特异性ssdAb中，筛选出对NOR靶标结合能力最好、灵敏度和特异性较佳的1N9
ssdAb。其在NOR阴性和NOR阳性鱼基质的检测中，基质干扰效应低，回收率好，可作为NOR免疫分析检测新的潜在抗体材料。【原文出处】
Chang Liu, Yuan Chen, Hong Lin, et
al. Shark-derived single-domain
antibody as a new and effective recognition element for norffoxacin detection
[J]. Journal of Food Composition and
Analysis,2024.
原文链接： https://doi.org/10.1016/j.jfca.2024.106385
指导教师：王战辉
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