---------【引语】---------
磺胺类药物是一类具有对氨基苯磺酰胺公共结构的合成抗菌药，其可与对氨基苯甲酸竞争结合二氢蝶酸合成酶DHPS，从而抑制微生物叶酸的从头合成，达到抑菌的目的。2015年在欧盟，磺胺类药物（11.8%）和β-内酰胺类药物（25.0%）与四环素类药物（32.8%）占食品动物药物总量的近70% 。为保障食品安全，建立可简单、快速、灵敏的同时检测一类磺胺类药物残留的免疫分析方法至关重要。抗体是免疫分析的关键试剂，但是目前已有的磺胺类药物抗体普遍存在灵敏度差、识别性能不均一的问题。而DHPS以其均一的识别性能，是替代抗体的不错选择，因此制备识别性能类似于DHPS的抗体是亟须解决的关键问题。
本研究首先使用表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）分别测定了本团队前期制备出的磺胺类药物单抗mAb 4C7、4D11以及DHPS与29种磺胺类药物、5种半抗原以及3种类似物的动力学过程，获得了解离速率常数（kd）、结合速率常数（ka）和平衡解离速率常数（KD）。基于磺胺类药物的结构和其对应的pKD值，分别构建了mAb 4C7和4D11的三维定量构效关系模型（three-dimensional quantitative structure-activity relationship, 3D-QSAR），从配体角度解释了不同磺胺类药物对同一抗体亲和力存在差异的原因，并获得了新型半抗原设计的重要信息。酶解制备了Fab 4C7，通过结晶、X光衍射，获得了Fab 4C7以及其与磺胺噻唑（sulfathiazole, STZ）复合物的晶体结构。借助分子对接，在受体层面上，分析了mAb 4C7对不同磺胺类药物识别存在差异的分子机制。基于已有的DHPS与磺胺类药物的晶体结构，解释了受体蛋白识别磺胺类药物性能均一的原因，进而在分子水平上阐述了抗体与DHPS在识别磺胺类药物过程中的差异，为新型半抗原的设计、抗体的体外进化奠定了基础。通过比较mAb 4C7和4D11的氨基酸序列和三维空间结构，分析了不同抗体对磺胺类药物识别存在差异的原因，为广谱性磺胺类药物抗体的筛选与制备提供了思路。
---------【成果简介】--------
SPR结果显示，mAb 4C7对磺胺类药物的亲和力介于2.36 pM至57.4 μM，mAb4D11对磺胺类药物的亲和力介于2.41 pM至10.6 μM，而DHPS对磺胺类药物的亲和力介于0.153 μM至5.83 μM，表现出卓越的均一识别性能。值得注意的是，单环类氨苯磺胺（sulfanilamide,SN）对mAb 4D11的亲和力为10.6 nM，其分子可以以较快的速率和抗体结合（ka 1.29´105M-1 s-1），但复合物并不稳定，其较快解离（kd 1.37 ms-1），最终产生中等的亲和力。
mAb 4C7的比较分子力场分析（comparativemolecular field analysis, CoMFA）的结果显示，磺胺类药物的立体场（51.7%）和静电场（48.3%）对其和抗体结合的贡献相当。mAb 4D11的CoMFA的结果显示，磺胺类药物的立体场（49.1%）和静电场（50.9%）对其和抗体结合的贡献相当；当磺胺类药物的立体场和静电场与免疫半抗原越相近，磺胺类药物与抗体的亲和力越高；构建的模型能够较好的解释不同磺胺类药物因分子组成、空间构象以及取代基位置和组成不同，造成与同一抗体的亲和力存在差异的分子机制。结果提示，在新型半抗原设计中，需要同时考虑构象和静电势分布，公共骨架对氨基苯磺酰胺部分需要保留，不宜在杂环的邻位引入大体积或供电子基团，对位引入基团的效果会优于间位。
试验解析了Fab 4C7的晶体结构，其PDB ID为5CP7，分辨率为3.00 Å，并解析了Fab 4C7与STZ共结晶的结构，其PDB ID为5CP3，分辨率为1.99Å。结果显示，STZ位于轻链CDR1、CDR3和重链CDR3形成的空穴中，磺胺类药物骨架对氨基苯磺酰胺朝向口袋内侧，五元噻唑杂环朝向口袋外侧。STZ的芳伯氨基（NH2-）与CDR L3的Q101，磺酰基中的两个氧（O-）分别与CDR L1的N39以及重链W103，噻唑环中的氮（N-）与轻链R51和CDR H3的G100生成分子间氢键。位于CDR L3的W94、重链的H36与STZ的苯环，CDR H3的Y99与苯环、噻唑环存在p-p相互作用。分子对接结果显示，因位于磺胺类药物公共骨架上的芳伯氨基和磺酰基与mAb 4C7上的CDR L3的Q101、重链的N38、CDR L1的N39、重链的W103残基生成分子间氢键，使得不同的磺胺类药物可与mAb 4C7结合，但因不同磺胺类药物的五元或六元杂环等取代基不同，分子朝向不同，使得与mAb 4C7的氨基酸残基生成额外的不同的氢键，造成亲和力存在差异。结果提示，可以考虑将mAb4C7进行体外进化，仅保留与磺胺类药物公共骨架相互作用的氨基酸残基，以期得到的突变体对磺胺类药物具有均一的识别能力。
本研究分析了已有的B.anthracis DHPS与DHP+和STZ复合物的晶体结构（PDB ID 3TYE），E. coli DHPS与DHP和SN复合物的晶体结构（PDB ID 1AJ0），Y. pestis DHPS与DHPPP和sulfamethoxazole (SMX)复合物的晶体结构（PDB ID 3TZF），结果显示，DHPS有两个活性位点，其一是与蝶呤结合的口袋，位于内部；其二是磺胺类药物的结合口袋，有两个具有柔性但保守的Loop 1和2组成。磺胺类药物与DHPS的识别主要分为：首先，DHPPP与DHPS结合，脱去焦磷酸基团，生成稳定的阳离子中间体DHP+；其次，焦磷酸基团的释放和Mg2+的加入，使DHPS的Loop 1和2的构象发生变化，与磺胺类药物结合；最终，磺胺类药物的芳伯氨基与DHP+的9位碳发生SN1加成反应，生成新的DHP-磺胺加成产物，焦磷酸被释放。结果提示，DHPS均一识别磺胺类药物是通过亲核加成反应来实现的，虽然磺胺类药物五元或六元杂环等取代基不同，但并不与DHP+和DHPS发生相互作用；抗体是通过非键相互作用来识别磺胺类药物的，其均一的识别性能很难达到。
通过比较mAb 4C7和4D11的氨基酸序列及其结合口袋可知，4C7的CDR H3比4D11少了6个氨基酸残基，且溶剂可及表面积小了1倍，这可能是造成两个抗体识别存在差异的主要原因。另外，免疫半抗原的结构不同，是造成抗体性能存在差异的根本原因。结果提示，广谱性磺胺类药物抗体的制备需要合理设计半抗原的结构，大批量免疫、筛选并结合高通量测序等生物信息学手段。
---------【图文导读】--------
图1 化合物的分子结构 |
表1 SPR测定结果 |
图2 基于配体的3D-QSAR结果 (A) SMX为mAb 4C7模型中配体结构叠合所使用的模板分子，SDM为mAb 4D11模型中配体结构叠合所使用的模板分子；(B) 通过模型拟合得到的pKD值和试验测定的pKD值的相关性分析；(C) mAb 4C7模型中配体分子叠合构象图；(D) mAb 4C7模型立体场分布情况，绿色色块增加体积会增强活性，黄色色块减少体积会增强活性；(E) mAb 4C7模型静电场分布情况，蓝色色块增加正电荷能增强活性，红色色块增加负电荷能增强活性；(F) mAb 4D11模型中配体分子叠合构象图；(G) mAb 4D11模型立体场分布情况；(H) mAb 4D11模型静电场分布情况。 |
图3 Fab 4C7结合口袋及其与STZ相互作用图 (A) Fab 4C7结合口袋；轻链浅橙色，其中红色(CDR L1)、绿色(CDR L2)和蓝色(CDR L3)，重链浅蓝色，其中黄色(CDR H1)、洋红色(CDR H2)和蓝绿色(CDR H3)；(B) Fab 4C7残基与STZ相互作用，绿色为氢键，红色弧形线为疏水相互作用。 |
图4 Fab 4C7与磺胺类药物相互作用图 (A) SMT和STZ位于Fab 4C7结合口袋；轻链浅橙色，其中红色(CDR L1)、绿色(CDR L2)和蓝色(CDR L3)，重链浅蓝色，其中黄色(CDR H1)、洋红色(CDR H2)和蓝绿色(CDR H3)；(B) Fab 4C7残基与SMT相互作用，绿色为氢键；(C) SMX和SIZ位于Fab 4C7结合口袋；(D) Fab 4C7残基与SMX相互作用；(E) Fab 4C7残基与SIZ相互作用；(F) SDM和SIM位于Fab 4C7结合口袋；(G) Fab 4C7残基与SDM相互作用；(H) Fab 4C7残基与SIM相互作用；(I) SCP与SEP和SMP位于Fab 4C7结合口袋；(J) SMD和SMP位于Fab 4C7结合口袋；(K) Fab 4C7残基与SMD相互作用；(L) Fab 4C7残基与SMP相互作用。 |
图5 DHPS与磺胺类药物相互作用图 (A) B. anthracis DHPS与DHP+和STZ相互作用图；(B) B. anthracis DHPS与DHP-STZ加合物相互作用图；(C) E. coli DHPS与DHP和SN相互作用图；(D) Y. pestis DHPS与DHPPP和SMX相互作用图，黄色代表氢键。 |
图6 mAb 4C7与4D11相互比较图 (A) mAb 4C7与4D11可变区氨基酸序列比较，氨基酸序号及CDR注释采用Chothia命名；(B) mAb 4C7与4D11可变区三维结构比较；4C7中轻链浅橙色，其中红色(CDR L1)、绿色(CDR L2)和蓝色(CDR L3)，重链浅蓝色，其中黄色(CDR H1)、洋红色(CDR H2)和蓝绿色(CDR H3)；4D11中轻链深橙色，其中黄色(CDR L1)、洋红色(CDR L2)和蓝绿色(CDR L3)，重链深蓝色，其中红色(CDR H1)、绿色(CDR H2)和蓝色(CDR |
---------【小结】--------
本研究在结构和分子水平上，阐明了不同抗体和受体对不同磺胺类药物识别存在差异的分子机制，加深了对半抗原与抗体相互作用机制的理解，为新型半抗原的合理设计、抗体的体外进化奠定了基础。
---------【原文出处】--------
Chenglong Li, XiaoLiang, Kai Wen, Yonghan Li, Xiya Zhang, Mingfang Ma, Xuezhi Yu, Wenbo Yu,Jianzhong Shen, and Zhanhui Wang*. Analytical Chemistry 2019, 91, 2392−2400.
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原文链接：
https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/abs/10.1021/acs.analchem.8b05174
参考文献：
Wang, Z.; Beier, R. C.; Sheng, Y.; Zhang, S.;Jiang, W.; Wang, Z.; Wang, J.; Shen, J. Anal.Bioanal. Chem. 2013, 405, 4027–4037.
Li, Y.; Wen, K.; Yu, X.; Li, C.; Wang, Z. Chin. J. Anal. Chem. 2015, 43, 366–370.
Wang, Z.; Liang, X.; Wen, K.; Zhang, S.; Li, C.;Shen, J. Biosens. Bioelectron. 2015, 70, 1–4.
Liang, X.; Li, C.; Zhu, J.; Song, X.; Yu, W.;Zhang, J.; Zhang, S.; Shen, J.; Wang, Z. Anal.Chim. Acta 2019, 1050, 139–145.
指导老师：王战辉
编辑校稿：杨玲
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