基于荧光的传感和成像技术被广泛应用于生物医学研究和诊断领域，传统荧光团的弱荧光性和低信噪比，导致这些技术相对低的灵敏度。而染料分子的荧光发射可以被等离子体纳米结构周围的强电磁场显著增强，这一现象也被称为等离子体增强荧光（PEF）。这种荧光增强可归因于两方面，一方面是等离子体纳米结构表面电磁场发生增强，另一方面是激发的荧光团与纳米结构表面等离激元耦合引起荧光寿命降低。为了实现高荧光增强效率，设计和实现具有高局域表面电磁场增强的等离子体纳米结构至关重要。比如通过电子束蚀刻的蝴蝶结耦合等离子体纳米结构，可实现单分子荧光增强1000倍以上，也有其他等离子体纳米结构复合体由于强的局域电磁场耦合可实现更高的荧光增强效果。但是这些等离子体纳米结构由于复杂的设计很难实现可控并规模化生产。
相比之下，单体纳米结构比如金纳米棒（AuNRs），由于其简单，粒径形貌可控的合成方法以及长期稳定性，且具有可调的LSPR峰而备受关注。通常使用的AuNRs直径约10-20nm，长约30-60nm，其荧光增强效果较弱，我们通过简单的优化AuNRs的尺寸，可实现荧光增强效率显著提升300%。本研究中，我们将AuNRs吸附到柔性薄膜上制备了等离子体贴片，并涂覆3nm硅烷作为间隔层，使用该等离子体贴片测定AuNRs尺寸对荧光增强效果的影响。另外，这种由最佳尺寸AuNRs组成的等离子体贴片通过附加步骤可应用到各种荧光免疫分析中，在不改变现有分析程序的基础上显著提升检测灵敏度。相比于小尺寸AuNRs的增强荧光免疫分析，优化的AuNRs可以提升人白介素-6检测灵敏度30倍，比普通荧光免疫分析灵敏度提升近3个数量级。最后，我们展示了尺寸优化的AuNRs等离子体贴片在提高10种人细胞因子微阵列灵敏度方面的实际应用。
最佳LSPR峰的确定
图S1（A）具有不同LSPR峰的AuNRs贴片的SEM图（LSPR峰分别为a:717nm，b:725nm，c:738nm, d:745nm, e:758nm，f:774nm, g:783nm, h:793nm）。（B）等离子体贴片转移到孔板底部后的消光光谱。（C）具有不同LSPR峰的AuNRs贴片对荧光增强的影响。（D）具有不同LSPR峰的AuNRs贴片对荧光增强因子的影响。（E）等离子体贴片转移到孔板底部后消光光谱与800cw的激发和发射光谱重叠示意图。
AuNRs尺寸对荧光增强效率的影响
接下来我们研究AuNRs尺寸对荧光增强效率的影响，先合成了具有相同长径比（约3.2）的不同尺寸AuNRs（图1E和F），它们的LSPR峰约为760±0.5nm（图1G）。并制备等离子体贴片，贴片由薄层PDMS柔性膜组成，其表面均匀吸附AuNRs（图1A），柔性特质保证了贴片覆盖在荧光物表面时的完整贴合（图1B-D），从而保证有效增强表面荧光团的发射。在每个贴片上吸附约50±6/μm2AuNRs（图2A），涂覆APTMS和TMPS间隔层后，转移到包被有800cw的96孔板底部，转移后也同样导致贴片LSPR峰与800cw激发和发射峰出现较大重叠（图2B和图S1E）。荧光增强因子随着AuNRs尺寸（长度和直径）增加而迅速增加（图2C和D），当AuNRs尺寸为为113×38nm2时，比单独800cw的荧光强度最大增强了120倍，比用小尺寸AuNRs贴片的荧光增强约3倍（图2C和D）。如果尺寸进一步增大，荧光增强因子则会下降。为了探究这种尺寸依赖的荧光增强现象，我们使用时域有限差分(FDTD)仿真模拟了不同尺寸AuNRs的局域电磁场强度（图2E）。模拟发现，距离其表面3 nm处的电磁场强度（考虑硅烷间隔层）随着AuNRs尺寸的增加而迅速增加，长度为110 nm的AuNRs达到最大值，AuNRs尺寸进一步增大则导致电磁场强度降低（图2F）。这与实验得到的AuNRs尺寸依赖性荧光增强现象是一致的。
图1 AuNRs贴片尺寸依赖性增强荧光。（A）基于柔性等离子体贴片增强荧光的简单“附加”过程的示意图。（B）由金纳米棒（AuNRs）组成的等离子体贴片的。（C）等离子体贴片的SEM图像。（D）等离子体贴片和硅衬底之间界面的放大SEM图像。（E）不同尺寸AuNRs的SEM图。（F）E图中AuNRs的长径比。（G）不同尺寸AuNRs在水溶液中的消光光谱。
图2（A）不同尺寸AuNRs在PDMS膜上的SEM图。（B）由不同尺寸的AuNRs组成的等离子体贴片在转移到96孔板后出现的Vis-NIR消光光谱，与水溶液中的LSPR波长相比，它们表现出轻微的红移。（C）使用等离子体贴片前后的荧光强度对比。（D）不同尺寸AuNRs等离子体贴片的荧光增强因子。（E）FDTD模拟，显示了不同尺寸的AuNRs周围的电磁场（比例尺代表50 nm）。（F）显示不同尺寸（长度从46到200 nm）的AuNRs的电磁场强度增强曲线。
AuNRs密度对荧光增强的影响
接下来我们评估了AuNRs在PDMS膜上吸附密度对荧光增强的影响，将不同浓度AuNRs（尺寸为130×38nm2）沉积到PDMS膜上构建等离子体贴片，其SEM图见3A。随着AuNRs密度增加，贴片的LSPR峰强度也增加（图3B），同时其荧光强度也依赖性增加（图3C）。荧光增强因子随着贴片上AuNRs密度增加而增加，并在密度达到约48/μm2时趋于稳定（图3C和D）。为了理解荧光增强因子随AuNRs密度增加产生饱和性，我们进行了FDTD模拟（图3E-H），根据计算的消光光谱确定单个AuNRs（长度为 130 nm，直径为40 nm）在纵向LSPR波长下的消光截面为55,510 nm2，这表明约18/μm2的AuNRs足以吸收和限制大部分入射光。在FDTD仿真中，入射平面波的电场被设置为平行于AuNR的长轴（图3F），在实际情况中等离子体贴片上的AuNRs相对于入射光束的偏振是随机取向的，因此实验确定的荧光增强因子饱和时AuNRs的密度（40–50 AuNRs/μm2）略高于FDTD计算估计值（18 AuNRs/μm2）。
图3（A）具有不同AuNRs密度（130×40nm2）的贴片SEM图。（B）具有不同AuNRs密度等离子体贴片转移到孔板底部后的消光光谱。（C）使用不同AuNRs密度等离子体贴片后荧光强度图。（D）使用不同AuNRs密度等离子体贴片后荧光增强因子图。（E）入射光沿长轴偏振模拟的AuNRs散射截面积。（F）FDTD模拟示意图。（G、H）电场强度（背景）和坡印廷矢量（白色箭头）在Y-Z平面和X-Z平面中的分布（比例尺 50 nm）
AuNRs等离子体贴片在荧光免疫分析中适用性
在确定了AuNRs的尺寸及其在等离子体贴片上的密度后，我们测试了其改善常规荧光免疫分析参数（灵敏度、检测限、动态范围）的适用性。使用常规荧光免疫分析测定IL-6（图4A），最后简单的将等离子体贴片（使用长径比为3.25，尺寸为130×38nm2的AuNRs）转移到板孔底部。从结果来看，在使用等离子体贴片前，荧光信号极弱（图4B），检测限为600 pg/mL（图4E），使用AuNRs（57×18nm2及130×40nm2）等离子体贴片后，荧光强度显著增加（图4C和D）。另外，相比于使用小尺寸AuNRs（57×18nm2）等离子体贴片，使用大尺寸（130×40nm2）的获得更低的LOD，灵敏度提升约30倍（图4F和G）。除了增加灵敏度外，相比于常规ELISA，等离子体贴片增强的荧光免疫测定显示出更宽的动态范围（从0.2 pg/mL到6 ng/mL）。这些结果进一步验证了优化等离子体纳米结构以及扩展等离子体贴片在各种生物分析应用中的重要性。
图5（A）使用最佳尺寸AuNRs等离子体贴片测定10种细胞因子的蛋白阵列示意图。（B）在使用等离子体贴片前后荧光强度对比。（C）使用等离子体贴剂前后每种细胞因子的检测限。（D、E）使用等离子体贴片前后测定IL-6标准曲线。（F、G）使用等离子体贴片前后测定IL-alpha标准曲线。（H）使用等离子体贴片前后荧光信号稳定性的比较。
本研究中，我们系统地研究了AuNRs的尺寸对其荧光增强效率的影响，我们发现除了等离子体纳米结构的LSPR峰外，它们的绝对尺寸对最大化等离子体贴片荧光增强效率至关重要。使用FDTD模拟确定了具有最大电磁场增强性能的AuNRs尺寸，与实验中具有最大荧光增强性能的AuNRs尺寸完全一致。相比于未增强的荧光免疫分析，最佳尺寸AuNRs构建的等离子体贴片增强的荧光免疫分析灵敏度提升了3个数量级。高灵敏度和宽动态范围，结合已建立的生物检测平台（例如，96孔板、多重微阵列等）和工作流程，使等离子体增强荧光免疫分析在研究和临床应用方面极具吸引力。
指导老师：王战辉
抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展！
