大家好，今天跟大家介绍一篇1998年发表于Journal of Immunological Methods的文章：From absolute to exquisite specificity. Reflections on the fuzzy nature of
species, specificity and antigenic sites （从绝对特异性到精细特异性：物种、特异性和抗原位点模糊性的思考）。文章的作者Marc Hubert Victor van Regenmortel（1934年12月6日出生）是比利时病毒学家，以其在病毒分类方面的工作而闻名。尽管本文发表于25年前，但文中对抗体特异性的深度思考值得借鉴，论述内容相对科普，但文中的部分观点和数据并不严谨，请读者注意甄别。【摘要】特异性（specificity）一词源于物种（species）一词。与物种一样，由于密切相关的物种之间没有明确的界限，因此本身定义具有模糊性。抗体特异性具有三元关系属性，指抗体区分两个或多个抗原表位的能力。构成抗原位点的各个重叠表位之间没有明确的界限，并且表位-互补位界面的原子位置也没有明确的最小差异，可以作为判断两个表位或两个互补位是否相同的标准。免疫学与其他经验科学一样，需要应对这种模糊的概念，但这种模糊性对免疫分析发展不是个大问题。1. 引言 Introduction免疫系统能够区分数百万个不同的分子结构和构成人类物种的数十亿个个体，这是脊椎动物进化最显著的成就之一。这种惊人的辨别能力解释了免疫识别是生物学中存在的最具体的分化机制。尽管X射线晶体学研究已经在多个层面阐明了抗原/抗体相互作用的分子基础，但学界对免疫识别机制的理解仍然相当初级。例如，我们无法从复合物结构预测抗原和抗体相互作用能，也无法对抗原抗体相互作用发生时的相互适应和诱导契合后实现成功对接。本文的目的不是回顾目前对免疫识别过程的理解，而是讨论特异性本身的概念以及这一概念在免疫学领域的应用。2. 什么是特异性？What is specificity?尽管特异性的概念在生物学中被广泛使用，但很少有人试图对其进行定义。在1978年出版的《生命科学》一书中，Medawar给出了以下定义：“特异性是药剂与作用物之间或指令与执行之间的完全互补关系。”该定义的第二部分指的是通常所说的生物特异性，主要是遗传信息的传递。该定义的第一部分侧重于本文所关注的免疫识别中特异性含义，该含义广泛涉及酶与底物、受体与配体或抗原与抗体之间的互补性。任何两个伴侣分子之间的立体化学互补性都会产生一种称为分子识别的结合过程。抗体识别是由多功能的结合位点介导的，称为互补位点（paratope），由六个高变序列环组成，这种独特的功能设计能够识别几乎任何分子结构。免疫球蛋白分子的互补位识别蛋白抗原中的一组原子，这些原子一般并列排列在蛋白三维表面上，共同形成抗原表位（epitope）。形成特定表位的原子簇具有各自特性，即只能通过其与互补位结合的能力来识别。同样，由互补位定义引申出免疫球蛋白的抗体特异性，也只有在识别出抗原中的互补表位后才能确定。因此，表位（epitope）和互补位（paratope）是一种关系实体，只能通过相互互补性来定义，而不能通过独立于关系之外的各自的任何内在特征来定义。单独定义表位就像在没有妻子的世界中定义丈夫一样，没有意义。特异性一词源于物种一词，它描述了与物种有关的内容和特征。可以追溯到亚里士多德的悠久思想，即认为每个物种都是一个独立的实体，与其他物种完全不同，并具有独特的永恒本质。这种在物种之间设置明确的区别和界限的思想被称为本质主义，但其最终被强调自然选择和达尔文物种进化和物种转变的新思想所取代。然而，对物种固定性和个体性的信念在本世纪继续影响着生物学思想，它也决定了许多生物学家和化学家使用特异性概念的方式。保罗·埃尔利希只从绝对特异性的角度考虑特异性，他否认不同细菌物种的抗原之间可能存在血清学交叉反应的可能性。罗伯特·科赫也强调细菌物种之间的不连续性和分离性，并否认特异性可能是一个程度问题的观点。他对特异性的描述为近乎神秘。科赫属于一种强调不连续性而非连续性的思想传统，这种思想传统提倡分裂主义者和多元主义者，而不是统一主义者和一神论者。另一个极端是卡尔·冯·纳吉利，他认为自然是连续的，每个边界都是任意的，只有人类的思想才能创造出具有绝对边界的物种等明确的概念。鉴于对物种的态度与特异性之间的联系，简要回顾一下所谓的物种问题可能会有所启发。3. 物种的模糊性 The fuzzy nature of species值得注意的是，在达尔文的《物种起源》发表一个多世纪后，人们对物种的认识却比以往任何时候都更加模糊。尽管本世纪生物科学和分子生物学取得了巨大发展，但目前对于植物、动物或微生物物种的构成尚无普遍共识。在最近一次专门讨论生物学物种问题的会议上，对多达22种不同的物种概念进行了比较，会议上的一篇论文题为：“The ideal species concept and why we can’t get it”。有人指出，生物学家无法就物种的定义达成一致，是因为物种问题从根本上来说是一个哲学问题。其中一个困难来自于“物种”一词不同含义之间的语义混淆。物种这个词可能指的是一种用于构建分类的抽象类别，其在时间或空间上没有任何对应位置。它也可以指由一类真实生物组成的具体实体，称为分类单元（taxon）。更严重的问题在于物种类别的异质性，这是由于生物学家对生物统一性和多样性的概念化方式多种多样。鉴于自然界中发现的变异模式多种多样，Kitcher对物种的定义提出了一种多元化的方法，认为没有一种关系模式适用于所有的生物群体，几种物种概念是等效的。表型或形态学的物种概念是基于同类成员的整体相似性，它不考虑将系统发育血统作为分类标准。然而，系统发育在有亲缘关系的物种中并非完全不存在，因为观察到的生物体之间的亲缘差异程度通常与它们共同祖先发生的进化变化的数量成正比。在某种程度上类似的方式，生物体中基因组序列相似性的程度可用来重建可能的系统发育。根据生物物种的概念，物种被定义为与其他种群生殖隔离并在自然界中占据特定生态位的杂交自然种群。由于种间杂交的发生和相隔仅几公里的植物群落之间缺乏基因流动，通常很难将这一概念应用于植物。一般而言，很难确定什么是显著的繁殖不连续，就像很难确定什么是显著的遗传不连续一样。另一个主要的物种概念是指进化物种，其定义为“祖先-后代种群的单一谱系，它保持着与其他谱系不同的特征，并有自身的进化趋势”。这一概念强调时间维度，但并未提供任何关于物种可以追溯到多远的指导。地球上的生命是一个生物连续体，为识别进化物种在时间上划分界限，就像是为识别生物物种而定义明确的繁殖不连续一样困难。这些困难导致人们认为物种对应于具有模糊边界的模糊集合，并且不可能像亚里士多德的经典集合那样在它们之间划出清晰的界限。当被视为模糊集合时，物种对应于综合分类，并以Wittgenstein定义游戏概念的方式定义，即每个游戏可能具有一个或多个与其他游戏共同的特征，但并非所有游戏都具有相同的特征。Beckner在生物学中引入了此类对象类别，并将它们称为多型类（polytypic classes），该术语后来改为多原则分类。在多原则分类中，没有一个属性是该类所有成员必须共享的，这使得可以容纳缺乏该类典型特征的个体成员。当物种被视为具有可修改和朦胧边界的模糊集合，而不是具有明确和不变边界的经典集合时，协调类别成员和进化变化也没有任何困难。物种的多原则分类在病毒学中特别有用，因为病毒通常不形成基因库。病毒随时间不断变异，从一个物种到另一个物种的转变发生在复制的连续性中。随着变异积累，最终会得出结论，他正在处理的是一个单独的物种，尽管边界仍然模糊，无法划出明确的界限。达尔文早已清楚地认识到物种划分的主观性。1856年，达尔文在写给胡克的信中写道：“我一直在比较物种的定义……当博物学家们谈到‘物种’时，他们脑子里浮现出各种不同的想法，这真是有趣 ：在某些物种中，相似性就是一切，血统无关紧要；在某些物种中，相似性似乎毫无意义，创造才是主导观念；还有的将血统传承视为关键；也有把不育性作为绝对测试标准的，而对另一些人来说，不育性又一文不值。我相信，这一切都源于试图定义无法定义的事物”4. 模糊逻辑 Fuzzy logic本文之后讨论了“模糊逻辑”的概念，用以处理那些没有明确界限的实体和概念，比如物种定义中的模糊性。传统的二元逻辑认为事物要么是要么不是，而模糊逻辑则允许事物处于中间状态，从而更适合描述现实世界中的连续体，强调了传统逻辑在面对生物复杂性时的局限性，主张使用模糊逻辑来更好地处理物种等生物学概念中的模糊边界问题，尤其在病毒学中，物种的界限非常模糊，病毒在时间上不断变异，难以划定明确的物种边界。模糊逻辑为处理这种模糊性提供了理论基础。具体的描述在此不再赘述，我们主要介绍关于特异性和抗原位点模糊性的部分。5. 免疫特异性 Immunological specificity免疫学中的特异性源于细菌学和罗伯特·科赫（Robert Koch）的工作。19世纪80年代，科赫利用改进的显微镜和染色技术，发现致病菌可以根据形态的恒定性以及生理和病理特性分为明显不同的物种。疾病的病因特异性原则要求，每种细菌疾病都应由不同的细菌物种引起。一般认为，不同的疾病不可能由同一种微生物引起，反之，不同的细菌也不可能引起同一种疾病。罗伯特·科赫是绝对特异性的坚定信徒，他不接受巴斯德的观点，即通过改变培养条件可以降低致病微生物的毒性，这可实现对疾病的免疫预防而不是导致疾病发生。科赫将巴斯德的发现解释为由于培养技术不佳而导致另一种微生物过度生长的原因。科赫对于细菌性疾病的绝对病原学特异性的观点，使他无法接受连续培养微生物毒力会消失的观点。细菌物种不变性的观点源于林奈，即植物物种被明确的不连续性所区分。在植物学中，植物的生殖器官是分类的基础，但这对细菌来说是不可行的，因此人们尝试使用形态和生理特征来代替。鉴于可用于诊断的形态特征很少，细菌学家转向血清学，希望通过细菌与特定抗血清的反应来区分不同种类的细菌。对细菌性疾病的病原学特异性和细菌物种之间绝对分离的观点，因此转变为对绝对血清学特异性的观点。保罗·埃尔利希作为罗伯特·科赫的思想继承者，将科赫的绝对特异性的观点扩展到了免疫反应领域。埃尔利希的侧链理论认为，参与免疫反应的细胞具有高度特异性的侧链受体，这些受体可以与抗原结合，并以如今所谓的抗体的形式从细胞表面脱落。由于认为每个抗体只对一种抗原具有特异性，并且每个细胞可以与大量不同的抗原结合，因此有必要假设细胞表面存在大量不同的受体（抗体）。此外，由于侧链理论假设每个受体中存在两个触点基团，一个与抗原反应，另一个与补体反应，因此埃尔利希认为每个受体也有一个匹配的补体分子。这种特定受体分子数量的不断增加是埃尔利希假设的典型特征，该方法假设一个新的特定实体来解释每个现象。Mazumdar曾对埃尔利希坚持的绝对特异性如何遭到汉斯·布赫纳(Hans Buchner)、马克斯·冯·格鲁伯(Max von Gruber)、朱尔斯·博尔德(Jules Bordet)和卡尔·兰德斯坦纳(Karl Landsteiner)的反驳进行了详细的记录，部分原因是埃尔利希原则违反了经济和简约原则并且完全是推测性的。当埃尔利希面对用牛红细胞免疫兔子产生的抗血清可以同时裂解牛和山羊细胞的困境时，他认为每种细胞类型都有一个独特的特异的受体，以及两种细胞类型共有的受体。这种解释是基于血清被异源细胞吸附后仍保留活性。相反，Landsteiner（兰德斯坦纳）认为不同动物物种细胞之间存在的血清交叉反应是一系列没有明显不连续性的逐渐转变。他的实验方法是测量交叉吸附后从细胞中洗脱出来抗体的活性。他发现从单一类型细胞中洗脱出来的抗体与各种其他异源细胞的反应程度不同，因此抗原和抗体之间没有一对一的关系。抗原不仅能诱导具有绝对特异性的单一互补抗体，而且还能诱导具有与相关抗原不同程度交叉反应潜力的整个抗体谱。Landsteiner认为，抗原特异性是一种或多或少的匹配问题，而不是一种全有或全无的识别现象。正如Berzofsky和Schechter所指出的，抗体特异性的概念与抗原交叉反应的概念是互补的。一种交叉反应，更恰当地说是共享反应（shared reactivity），是指一种特定抗体识别两种不同蛋白中的相同表位。这对应于Ehrlich所考虑的绝对特异性，因为抗体以相同的方式与两种蛋白抗原中的相同互补表位发生反应。另一种交叉反应，被Berzofsky和Schechter称为真正的交叉反应（true cross-reactivity），是指抗体识别异源抗原上的表位，该表位与同源抗原的表位不同但在结构上相关（图1）。通常，抗体互补位会以更高的亲和力与同源表位发生反应，而抗体互补位与其他相关表位结合更紧密的情况并不少见，这种现象称为异特异性（heterospecificity）或异位结合（heteroclitic binding）。异特异性很普遍，只要寻找它就会发现，例如当抗体与一系列与免疫原密切相关的类似物进行测试时。
图 1. 两种相关抗原1和2之间的潜在交叉反应。表位a存在于两种抗原上，而mAb anti-a将以相同的方式与抗原1和2发生反应。mAb anti-b和anti-d识别两种抗原上不相关的表位，不会显示交叉反应。mAb anti-c与同源表位c发生强烈反应，与异源表位e发生微弱交叉反应异特异性并不出人意料，因为B细胞的克隆选择最终导致抗体产生，而这种选择可以通过对B细胞受体具有中等亲和力的免疫原触发。表位和互补位之间的最大程度契合并不是启动B细胞分化所必需的，鉴于抗体具有广泛的多特异性，发现对免疫原具有低亲和力的抗体可能对相关抗原具有更高的亲和力，这并不奇怪。通常认为特异性的增加与亲和力更高的抗体相关，因为这种抗体必然比亲和力较低的抗体具有更好的与抗原的立体化学互补性。然而，亲和力和特异性之间没有必然联系，亲和力低的抗体往往比亲和力高的抗体更能区分两种抗原。正如表位只能根据其互补的互补位来定义一样，如果不确定特定的抗原/抗体对，那么谈论抗体亲和力也是毫无意义。同样，抗体特异性是一种三元关系属性，只有当抗体与两种或多种抗原发生不同反应并区分它们的识别能力时，它才有意义。当半抗原的大小达到500 Da（相当于大约4个氨基酸残基）时，表位大小与抗半抗原抗体的亲和常数之间存在相关性，其最大值往往约为Ka 1010M1。抗蛋白抗体的亲和常数很少超过该值，这可能是因为难以在大至800 Å2的互补位和表位间实现高度的立体化学契合。如此大的界面上不完美的立体化学互补性导致存在许多充满间隙水的空腔，并对可以达到的亲和常数存在更高的限制。在抗原-抗体相互作用中通常遇到的亲和常数范围（Ka 103-1010 M1），最大约等于40 kJ/mol的自由能差。这意味着当抗体与异源抗原发生交叉反应时，仅损失几个能量为2-8 kJ/mol的氢键就可能使亲和常数降低到检测结合所需的阈值以下。因此，亲和力低的抗体可能比亲和力高的抗体检测到更少的交叉反应，因为后者往往会保留更多的对异源抗原的残留结合活性。因此，亲和力较低的抗体更具鉴别性，这使得它们比亲和力高的抗体更具特异性。基于同样的原理，制造商有时会通过提供更高的稀释度来人为地提高其血清学试剂的特异性。6. 从绝对特异性到精妙特异性 From absolute to exquisite specificity从前面的讨论中可以清楚地看出，绝对抗体特异性的概念是没有意义的。杂交瘤技术和单克隆抗体（mAb）的出现，已经阐明了epitope-paratope相互作用的结构基础，并产生了一种新的表征抗体识别性质的称谓，即精妙特异性（exquisite specificity）。单克隆抗体的使用消除了以前通过异质抗血清分析抗原时遇到的解释困难。通过一次聚焦单个表位，阐明了表位之间交叉反应的本质，并证明了抗体互补位检测表位之间最小原子差异的“精妙”能力。抗体结合位包括六个互补决定区（CDR），它们形成抗体分子两个可变区末端的高变序列环（loops）。大约50个构成CDR的氨基酸残基视为一个潜在的结合口袋，但每个特定的互补位仅由这些残基的约三分之一组成。因此，同一抗体分子理论上可能包含两个完全独立的paratope，对应于不相关表位的两个互补位。更常见的是，免疫球蛋白结合口袋中存在的不同paratope部分重叠，在这种情况下，与一个paratope结合会阻止第二个表位结合另一个paratope。由于抗体约三分之二的CDR残基不参与与其互补表位的相互作用，因此抗体具有多特异性也就不足为奇了，即能够与一组结构相关或不相关的抗原结合。抗体与其抗原之间的关系从来都不是排他性的，除了识别其所针对的表位外，抗体还会与具有某些结构特征的各种相关表位结合。通过mAb对一组相关抗原进行表位定位，为描述各种类型的交叉反应提供了一个简单的框架。如图1所示，两种抗原之间的交叉反应可能是由于mAb识别相同表位a时具有相同的反应性，也可能是由于mAb能够识别两个相关表位，例如c和e。图1还为一个棘手的问题提供了答案，即mAb还是多克隆抗血清更具有特异性？答案是除非是要明确区分什么靶标，否则这个问题实际上毫无意义。如果目的是区分抗原1和抗原2，则mAb抗a应被视为非特异性，而mAb抗b和抗d应被视为高度特异性，因为它们根本不发生交叉反应。为了区分这两种抗原，由抗a、b和c抗体混合物组成的多克隆抗血清比mAb抗a特异性更强，但比mAb抗b特异性更低。事实上，将mAb称为对抗原、病毒株或细胞等实体具有特异性是一种误导，因为抗体只能对表位具有特异性。特异性概念的部分混淆源于从表位到多表位抗原的转变。在大多数情况下，研究人员希望区分两种抗原，从而可以确定特定抗原-抗体反应是否具有特异性。如果试剂达到了特定情况下所需的鉴别水平，则称其为特异性试剂，而同一抗体可能根据当前任务被视为特异性或非特异性。在这种情况下，谈论鉴别潜力比谈论特异性更有意义。7. 抗原位点和表位 Antigenic sites and epitopes蛋白质的抗原位点对应于抗原表面的可及区域，这些区域可被多种不同的抗体识别。与每种抗体接触的抗原表面的大小相当于一个抗体足迹，覆盖面积约为800 Å2。蛋白质抗原的整个可接触表面由大量重叠的表位组成，不可能在许多不同表位的单个抗原位点之间划出清晰的界限。蛋白质抗原的相同残基可能涉及由单个原子团构成的许多不同表位，这些原子团以独特的方式与不同的互补位相互作用。每个互补位的CDR环相对于抗原位点的方向可能不同。并且，表位/互补位相互作用的一个有趣特征，即相同的抗原位点可被两个完全没有序列相似性的互补位识别。相反的情况也存在，因为同一抗体有时可能会识别两个没有任何序列相似性的表位。鉴于表位和互补位的相关性，可以根据蛋白质能够诱导的不同单克隆抗体的总数来估计其表位数量。根据这一标准，例如，胰岛素分子预计至少包含115个表位。当抗体识别相关抗原中略有不同的表位时，严格来说，这些抗原结合的是不同的paratope，因为发生相互作用的至少一些原子会有所不同。再次到达模糊的边界，这使我们无法在非常相似但不相同的表位和互补位之间划出清晰的界限。一旦表位中的一个原子团或氨基酸残基发生改变，并影响到与抗体的结合，表位和互补位就不再相同。在表位-互补位界面的原子位置上没有明确的最小差异，可以作为决定两个表位或两个互补位不再相同的绝对标准。随着动力学结合测量精度的提高，可以检测到结合亲和力的微小差异，而将这些差异与抗原/抗体界面原子位置的微小变化联系起来的任务变得越来越困难。此外，蛋白质中整个残基的替换可能会产生微小的结构变化，这些变化会远远超出突变区域，在目前的结构数据分辨率下无法检测到，尽管它们可能会影响结合活性。分子生物学和免疫学中结构解析催生了一种结构主义范式，根据该范式，仅基于结构信息就可以充分解释特异性。对于表位，这种方法可以定义所谓的结构表位，该表位由15-20个氨基酸组成，这些氨基酸与互补位接触。这种描述具有误导性，原因有几个：首先，相互作用应以原子相互作用而不是整个残基来描述，因为给定残基的所有原子甚至大多数原子都不太可能参与相互作用。其次，使用具有单一残基或原子团取代的类似物进行的结合测量表明，每个paratope-epitope中只有三到五个残基的原子对相互作用的结合能有贡献。这导致了所谓的“能量”或功能性表位的定义实际上比结构表位小得多。这些发现表明，表位不仅是一个可由空间坐标定义的结构实体，而且这个概念还需要一个只能通过分析结合活性才能理解的特定功能。以结合测量形式的功能分析相当于询问与之结合的分子特性。这些测量取决于动力学上的结合速率和解离速率（Kon and Koff），侧重于相互作用的时间分量。基于亲和常数和结合能的回答与用于描述空间的坐标并不对等。在生物学领域分析结构-功能和结构-活性关系的困难源于难以在两种分析框架中建立联系。根据两个伴侣分子的空间坐标预测抗原/抗体分子的对接和计算结合能目前并不是现实的科学目标。通常发生在两种反应物之间的相互适应和诱导契合过程导致的在复合物中观察到的互补性，在游离分子相互作用之前可能无法检测到。表位和互补位之间的关系既有空间成分，也有活性成分，而我们往往会将实际上属于时空连续体的个别特征区分开来。当前模糊性观念的流行不会对免疫化学分析的持续发展及其在生物学和医学中的许多应用构成威胁。【原文出处】Van Regenmortel M H V. From absolute to exquisite specificity. Reflections on the fuzzy nature of species, specificity and antigenic sites. Journal of immunological methods, 1998, 216(1-2): 37-48.原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022175998000696抗体故事分享基于抗体的分析方法研究进展，欢迎投稿！
