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酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术、免疫印迹常用于定性或定量检测复杂生物标本中的小分子或大分子物质用于医学研究或临床诊断，具有多功能性、特异性和操作简单的优势。虽然这些免疫测定的技术模型不同，但这些测定背后的共同原理是基于使用检测抗体对目标分子和抗原的特异性识别。在大多数情况下，固定在固相材料(如96孔板和硝化纤维素膜)或表达在细胞表面的抗原丰度通常较低。少量的抗原只允许有限的检测抗体积累，导致在免疫测定中检测抗原的信号不足。合理地增加在抗原处积累的检测抗体的数量，将大大提高各免疫检测的检出限和灵敏度。为了提高免疫分析的灵敏度，各种抗体包被纳米颗粒或聚合物被开发出来，大量的检测抗体可以通过在纳米颗粒上覆盖高密度的抗体而在一个抗原上积累，从而有效的增加了免疫检测的检测信号。然而，这些抗体包被纳米粒子的制备是复杂和缺乏一致性的。在本研究中，作者构建了一种可与IgG型免疫球蛋白Fc区域高选择性、高亲和力结合的可溶性多聚蛋白G (8pG)，以提高各种免疫测定方法的检出限和灵敏度。8pG是通过将链球菌蛋白G的8个C2结构域融合成一种均匀重复的聚合物而开发出来的，这种聚合物允许每个8pG分子在其支架上捕获多达8个检测抗体。将8pG与检测抗体一步混合即可产生抗体/8pG复合物，大大增加了检测抗体与靶抗原的相互作用。分别用Western blot和SDS-PAGE检测8pG的表达和纯度。通过将辣根过氧化物酶(HRP)-偶联抗体添加到8pG包被或BSA包被的微板上，来评估8pG的抗体捕获特异性。此外，将8pG与各种检测抗体混合，以证明在不同的免疫检测中，包括直接ELISA、夹心ELISA、Western blot和流式细胞术，检测限和敏感性的提高。
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聚蛋白G (8pG)的开发与表征，来自链球菌的重组蛋白G可以特异性地与各种物种的免疫球蛋白特别是IgG型结合，在抗体纯化技术中得到了广泛的应用，在这里，8pG被设计为8个纵列重复蛋白G C2结构域与一个c -末端6 - His标签连接的聚合物，在不同的免疫检测系统中，可以在不干扰其抗原结合能力的情况下特异性地捕获大多数商业检测抗体的Fc区域，重组8pG可由Expi-293生产细胞大量生产，产量为>100 mg/L。Western blot分析显示，8pG的预期表达量为60 kDa。SDS-PAGE分析表明，经亲和层析纯化后，8pG纯度较高。利用不同物种(包括山羊、小鼠、驴和兔)的HRP标记的IgG免疫球蛋白对8pG或bsa包被的微板进行着色，验证了8pG的抗体捕获能力。检测抗体与8pG简单混合，增强直接ELISA的检测信号，评价8pG是否能提高直接ELISA的检出限和灵敏度，分别添加是否混入8pG的生物素化的anti-PEG抗体(称为3.3-生物素)进入涂有不同数量的PEG5K-NH2的微孔板，然后依次加入HRP链霉亲和素和ABTS底物。结果显示，8pG组(3.3-生物素与8pG混合)检测不同量PEG5K-NH2的吸光度分别比单独使用3.3-生物素组高11.52倍、3.63倍、1.6倍、1.5倍和1.2倍。8pG组对PEG5K-NH2检测限低至0.69 ng/well，3.3-生物素组的检测限为6.2 ng/wel。作者还将8pG应用于另一种直接ELISA系统中，用于检测可溶性重组人CTLA4 (rhCTLA4)。结果与检测PEG5K-NH2相似。有趣的是，在直接ELISA检测中，8pG显著提高了抗体在低密度下对peg5 - nh2或rhCTLA4的敏感性，而在高密度下则没有。推测在抗原密度高的情况下，如果抗体/8pG复合物以平躺的方式与抗原结合，则会掩盖附近的抗原，使其他抗体无法与被掩盖的抗原结合，导致检测灵敏度有限。相反，在抗原密度低的情况下，无论抗体/8pG复合物是直立还是躺下，都不会干扰其他抗体与邻近抗原的结合。值得注意的是，即使抗体/8pG复合物对高丰度抗原的识别存在空间位阻，8pG组的检测灵敏度仍优于传统的单纯抗体组。检测抗体与8pG简单混合，增强夹心ELISA的检测信号，进一步验证8pG是否提高了不同的商业夹心ELISA试剂盒的检测限和灵敏度,即anti-PEG夹心酶联免疫试剂盒。将不同浓度的聚乙二醇IFN-α(派罗欣)、聚乙二醇脂质体阿霉素(脂肪-阿霉素),或聚乙二醇量子点(Q点)到包被IgM anti-PEG抗体(称为AGP4)的微孔板中，然后加入3.3-生物素或混合8pG的3.3-生物素，数据表明，8pG可以显著增强以抗PEG抗体为基础的夹心ELISA试剂盒，用于高敏检测包含不同核心材料的PEG偶联大分子，如蛋白质、脂质体和无机纳米颗粒等。作者认为，8pG可以很容易地、无冲突地与这些信号放大策略配合，进一步提高抗体与抗原结合的效率和数量，使三明治型免疫分析具有超敏性。检测抗体与8pG简单混合，增强Western Blot检测信号，Western blot是一种广泛应用于从复杂生物标本中根据分子量分离出特异性蛋白的技术。然而，Western blot的检测限和敏感性往往受到不足的检测抗体与转移膜上的少量靶向蛋白结合的限制。将8pG作为信号增强子应用于两个Western blot系统中，分别使用3.3-biotin抗体和抗CTLA4抗体检测聚乙二醇干扰素和rhCTLA4。结果显示，各8pG组(抗ctla4抗体或3.3-生物素与8pG混合)的检测信号明显高于抗体单独组。8pG组检测rhCTLA4的检出限提高到0.2 ng/well，而抗ctla4抗体单独组的灵敏度为6.3 ng/well。单独使用3.3-生物素组的检出限为1.3 ng/well，3.3-生物素与8pG混合后，检出限提高到0.1 ng/well。这些结果表明，8pG可以有效提高Western blot体系的检测限和灵敏度。检测抗体与8pG简单混合，增强流式细胞术检测信号，流式细胞术是一种检测细胞表面特异性蛋白的分析技术，在基础研究和临床研究中被广泛应用。然而，细胞表面的靶分子如果缺乏，这种技术可能无法有效地检测到。流式细胞术的检测限为每个细胞至少有100个靶向蛋白分子。8pG是一种分子量为60kda的小型蛋白质聚合物，其尺寸小于10nm。因此，我们利用8pG提高抗PD-L1抗体在流式细胞术中检测人PDL1-阳性HT-29人结肠癌细胞和人PDL1-阴性3T3小鼠成纤维细胞表面PD-L1分子的检测灵敏度。结果表明，8pG组检测HT 29细胞表面PD-L1的荧光信号比单独检测PD-L1的荧光信号高7.1倍，抗PD-L1抗体与8pG共混不增加PD-L1-阴性3T3细胞的荧光背景信号。这些结果表明，在不改变靶细胞粒度和大小的情况下，抗体/ 8pG复合物与细胞表面的靶分子结合可以显著提高流式细胞术系统的检测灵敏度。
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图1 8个重复蛋白G C2结构域聚合物(8pG)的示意图 |
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图5 是否存在8pG下的Western blot检测。 |
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在本研究中，展示了8个重复的蛋白G C2 结构域聚合物，8pG，它可以特异性地捕获来自不同物种的IgG型抗体的Fc区域，而不干扰Fab区域的抗原结合能力。简单地将8pG与检测抗体混合，一步即可产生检测抗体/8pG复合物，该复合物可显著增加检测抗体在特定抗原位点的积累，从而增强ELISA、Western blot、流式细胞术系统的检测信号。总的来说，认为8pG是一种强大的工具，可以普遍放大检测信号，提高临床诊断和生物医学研究中应用的各种免疫检测的检测限和灵敏度。
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Yi-Jou Chen, Michael Chen, Tian-Lu Cheng, Chang-Hung Wang, Che-Yi Chen and Kuo-Hsiang Chuang. Simply Mixing Poly Protein G with Detection Antibodies Enhances the Detection Limit and Sensitivity of Immunoassays. Anal. Chem. 2019, 91, 8310−8317.
指导老师：王战辉
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