抗体是重要的治疗制剂，人免疫库是治疗性抗体的优良来源。迄今为止，治疗性抗体多来自记忆B细胞，其表面具有膜抗体（mIg）因此可使用荧光激活细胞分选（FACS）筛选；抗体分泌细胞（ASC，包括浆细胞、浆母细胞）也是免疫库的重要组分，且ASC来源的抗体平均亲和力高于记忆BC，但分选难度较高限制了其应用。究其原因，ASC表面缺少mIg一般不能使用FACS分选，此外当前的分选技术也存在诸多局限，其中：无偏浆母细胞分选不能提供关于单个细胞抗原特异性的信息；酶联免疫斑点（ELISpot）分析无法回收抗原特异性细胞的基因信息；水包油乳液滴法很难在液滴中评价抗体功能；商业光流体系统需要昂贵的专用仪器不能规模化应用。为解决当前分选方法的局限性，剑桥大学的Hollfelder团队建立了一套使用常规FACS高通量筛选抗原特异性ASC的工作流程，以下是具体的研究内容：1.工作流程设计
大致分为以下4步（图1A）：1. ASC与液态的BG-琼脂糖（BG：苄基鸟嘌呤）混合，并以千赫频率封装到直径25微米的水包油乳液滴中。低温固化琼脂糖然后去乳化形成稳定的微囊，每个微囊包裹一个细胞；2.用融合表达SNAP标签的抗CL VHH将抗体固化在BG琼脂糖凝胶上（SNAP可与BG迅速、牢固地不可逆结合）（图1B）；3.加入荧光标记抗原表征被固化在微囊壁上的抗体，由于琼脂糖的孔径较大未结合的试剂可以通过洗涤去除；4.通过FACS分选单个水凝胶珠，并对其中的细胞进行测序、序列分析、表达。为验证该流程的实用性，用GFP-SNAP评估了BG-琼脂糖的载荷，发现其足以捕获数小时的分泌抗体而不饱和（图1C）；随后用市售链霉亲和素抗体验证该流程，发现被捕获的抗体结合能力并未变化且VHH、荧光抗原的结合表位无重叠，初步说明该流程具有一定实用性。![]()
图1. 单细胞分泌抗体的高通量功能分析工作流程
2.从单个小鼠骨髓浆细胞捕获抗体
首先根据细胞活率与抗体分泌量确定了细胞被微囊包裹后最佳孵育时间为1h45min。然后用OVA（卵清蛋白）免疫小鼠，将B细胞包裹在VHH功能化的水凝胶中并用荧光标记的抗CD138抗体、抗IgG抗体以及荧光标记的OVA进行染色。用共聚焦荧光显微镜发现IgG和OVA的信号在细胞周围的水凝胶中共定位，表明OVA特异性IgG的成功分泌和捕获（图1D）；还发现未捕获到细胞的空珠中没有IgG信号，说明在水凝胶中没有显著的抗体交叉污染。接下来封装了骨髓来源的浆细胞进行FACS分选（图1E），随后测序、表达，得到了两株高亲和力OVA抗体（图1F）。上述结果表明该流程能够有效筛选靶向特定抗原（如OVA）的高亲和力抗体。3.直接发现小鼠抗新冠病毒（SCoV2）受体结合域（RBD）抗体
用野生型（WT）SCoV2病毒的刺突蛋白免疫小鼠、从骨髓中富集浆细胞后（图2A），基于上述流程用荧光标记的RBD-链霉亲和素四聚体对RBD特异性浆细胞进行分选后对抗体进行测序（图2B），共得到54个抗体序列，根据其VH、VL基因将其分为20个克隆型，其中有5个优势克隆型（图2C）。这种抗原特异性浆细胞来源抗体群体中的高度克隆性与最近的人类IgG抗体库的蛋白质组学研究结果一致，表明该方法能够提供关于抗原应答中最主要抗体的见解。将这些抗体克隆型与冠状病毒抗体数据库（CoV-AbDab）进行比较，发现其中两个抗体与之前针对SARS-CoV-2刺突蛋白的小鼠淋巴结浆母细胞反应的研究中描述的抗体属于相同的VH克隆型。这表明在来自抗体分泌细胞的抗体中可以检测到免疫优势（immunodominance）。挑选26株具有代表性的抗体进行表达后评价了这些抗体的亲和力、病毒中和能力，发现虽然大多数抗体亲和力的较高但只有两株抗体具有WT SCoV2病毒中和能力（图2D&E），随后使用BLI表位分箱分析（binning analysis）（图2F）、晶体衍射（图2G）解析了这两株抗体的识别机制。![]()
图2. 小鼠抗SARS-CoV-2 RBD抗体的产生
4.人源抗SCoV2 RBD抗体的直接发现
调整上述流程，将捕获系统中的抗小鼠VHH换成抗人类κ和λ VHH后对富集的PBMC体外激活后进行分选，初步表明该系统能用于分选人源细胞。接下来在志愿者接种RNA疫苗（BNT162B2）7-9天后分选PBMC并通过阴性选择富集B细胞（图3A），分选出IgG+、RBD+的ASC（图3B）；设置了不加入VHH的阴性对照组，对照组中没有检测到抗原特异性的RBD+浆母细胞群体，说明传统表面FACS在该实验条件下不能分选出RBD抗体。本研究仅从一个志愿者中就获得了185条浆母细胞序列（图3C）；将这些序列与CoV-AbDab进行对比，发现17个序列与已有抗体属于相同克隆型，此外SPACE聚类分析还发现属于不同克隆型的抗体可能有相似的识别表位。挑选16株有代表性的抗体进行表达，评价了这些抗体的亲和力、对WT SCoV2以及奥密克戎毒株的中和能力，发现15株抗体具有较高亲和力，12株抗体能中和WT SCoV，5株抗体对奥密克戎毒株有可测量的中和能力（图3D&E）。最后用BLI表位分箱分析了7株强中和活性抗体的识别位点（图3F）。![]()
图3.人抗SARS-CoV-2 RBD抗体的产生
5.特异性抗体制备
为验证该流程能否制备特异性抗体，本研究从接种SCoV2 RNA疫苗7天的人PBMC中分离出B细胞，并将其包裹在水凝珠中，用荧光标记的S1亲和素与RBD亲和素同时对这些水凝珠进行染色（图4A）；选择在FACS信号比值上显示出最大S1/RBD比率的四个细胞（图4B），测序后表达为全长人IgG1（图4C），发现其中三株抗体对S1具有pM级的高亲和力；最后用ELISA测定了这些对RBD的交叉反应率，发现所有抗体均不识别RBD（图4D、E），说明本流程能筛选出靶标特异性抗体。图4.特异性抗体的筛选
综上所述，本研究将微流控技术和FACS结合开发了一种新型高通量的单细胞筛选技术，该流程能从ASC中快速发现高亲和力的特异性抗体，为治疗性抗体的制备提供了新技术手段。该技术的优点在于高效、快速：能够在几周内筛选出功能性抗体，此外模块化的设计使其能对不同物种、不同靶标的ASC进行筛选；其局限性在于细胞包封通量和测序产出有限，未来或许可以通过优化微流体芯片和引入二代测序提升分选效率和数据质量。【原文出处】
Fischer K ,Lulla A ,So Y T , et al.Rapid discovery of monoclonal antibodies by microfluidics-enabled FACS of single pathogen-specific antibody-secreting cells[J].Nature Biotechnology,2024.
指导教师：王战辉
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