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抗体-药物偶联物是一种对抗多种癌症的有力工具。由于药物偶联到治疗性抗体通常会改变如疏水性和效应功能等分子特性，从而导致品质劣化。所以，为了开发一种药物偶联方法以保持抗体的分子特性，我们设计了一个特定的肽偶联到抗体的Fc区域。我们分别使用曲妥珠单抗和螯合剂(DOTA)作为模型抗体和有效载荷，发现肽/DOTA偶联的曲妥珠单抗表现出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)增强和热稳定性增加。同时，通过详细的结构和热力学分析也表明，共轭肽像“楔子”一样阻断了Fc动力学。这种作用具体表现为降低分子熵导致ADCC增强，阻断Fc变性导致热稳定性增加。因此，我们认为该方法不仅在与药物偶联方法比较中体现出优越性，而且在增强治疗性抗体以提高ADCC和热稳定性的方面也同样具有优势。抗体-药物偶联物(ADC)结合了抗体的特异性和小分子药物的细胞毒性，是发展最快的生物制剂。一般来说，用于生成ADC的化学偶联技术针对抗体的天然氨基酸，如赖氨酸或半胱氨酸。大量的研究表明，与这些天然氨基酸的结合改变了抗体的特性，包括结构、表面电荷、溶解度(疏水性)和对相互作用分子(抗原、Fcγ受体(Fcγ rs)、新生儿Fc受体(FcRn)和补体)的亲和力。特别是在几篇报告中所讨论到大多数用ADC的细胞毒性药物是疏水的，因此降低了ADC的水溶性，然而低溶解度会导致抗体聚集，增加患者免疫原性的风险。这种分子不稳定性和细胞毒性之间的权衡限制了ADC的进一步发展。本研究的目的是开发一种简单而有效的方法，以维持ADC的分子特性的药物偶联。此前，Kishimoto等人描述了一种使用亲和肽(CCAP)与-抗体的Fc区进行化学偶联的方法。用CCAP方法制备的共轭抗体具有有趣的特征，包括增强的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。然而，其潜在机制仍然未知。在这里，我们首先对肽进行修饰以增加其溶解度，然后制备肽-和肽载荷共轭抗体。随后，我们详细评价了它们的分子特性，并阐明了其潜在的分子机制。 [研究内容]
一种23个氨基酸的肽，乙酰基-（赖氨酸[叠氮化物]）RRRGSGPDCAYHKGELVWCTFH-NH2，在Lys14位点用丁二酰亚胺戊二酸连接物(编号以赖氨酸[叠氮化物]开始)进行化学合成和修饰(图1A)。为了允许有效载荷偶联并增加偶联物的溶解度，基于先前报道的肽(GPDCAYHKGELVWCTFH)(称为“短肽”)延长了肽的N端。采用曲妥珠单抗(抗HER2人源化IgG1)作为模型抗体。肽的琥珀酰亚胺基团与Lys248的胺之间的胺偶联反应(本文中所有抗体残基按照EU编号进行编号)在曲妥珠单抗中在25°C下进行15 min(图1B)。偶联反应完成后，采用离子交换色谱分离单价肽偶联曲妥珠单抗和二价肽偶联曲妥珠单抗(分别称为“单肽”和“二肽”)。使用离子交换色谱和粒径排除色谱(SEC)确认样品的纯度(图S1A,B)。采用液相色谱/质谱(LC/MS)测定单肽和二肽的分子质量(图S1C)。从Fc与较短肽复合物的晶体结构中可以观察到，位于CH2和CH3之间凹槽的肽与Fc的Lys248共价结合(图1C)。我们的主要目标是将各种有效载荷，如治疗药物、DNA、放射性同位素和抗体结构域，与抗体结合。在第一次试验研究中，我们使用1,4,7,10 -四氮杂环十二烷-N，N，N，N-四乙酸（DOTA）作为模型有效载荷。DOTA可以用几种诊断和治疗放射性核素标记。用二苯并环辛基(DBCO)和聚乙二醇(PEG)修饰非螯合的DOTA，将单肽或二肽与DOTA试剂在25℃下混合。肽的叠氮-赖氨酸残基通过点击反应与DBCO的炔偶联(图1D,E)。偶联反应后，用离子交换层析法将DOTA偶联的单价曲妥珠单抗(monoDOTA)和二价曲妥珠单抗(diDOTA)进行分离。用离子交换色谱法和SEC法确定样品纯度(图S1A,B)。使用LC/MS测定单DOTA和双DOTA的分子质量(图S1C)。通过测定人外周血单个核细胞(PBMCs，效应细胞)对SK-BR-3细胞(HER2阳性细胞，靶细胞)的死亡情况，定量样品的ADCC。单肽、单DOTA、二肽和双DOTA样品的ADCC高于曲妥珠单抗(图2A)。四参数logistic曲线拟合(EC50移位)在统计上无效，因为在共轭时顶部和底部值都发生了变化。考虑到PBMC自然杀伤细胞(NK)上表达的FcγRIIIa在ADCC中起关键作用，因此，使用表面等离子体共振(SPR)测定样品对人FcγRIIIa (CD16a) V158的亲和力(图2B)(表S1)。曲妥珠单抗与FcγRIIIa结合，KD为51 nM。相对于曲妥珠单抗，单肽、单DOTA、二肽和二DOTA对FcγRIIIa的亲和力显著增加，范围从4.2- 18.3倍(图2C)。DOTA偶联单肽或二肽可轻度降低对FcγRIIIa的亲和力。使用FcγRIIIa固定柱的亲和层析也提供了肽/DOTA偶联曲妥珠单抗对FcγRIIIa亲和性增加的证据(图S2)22。与曲妥珠单抗相比，肽/DOTA偶联曲妥珠单抗的洗脱谱延迟。根据亲和力的温度依赖性得到范霍夫图(图2D)。通过范霍夫图计算了FcγRIIIa结合的热力学参数(图2E)。曲珠单抗以焓驱动的方式结合FcγRIIIa(ΔH= - 35.9 kcal/mol)，这被不利的熵损失(- TΔS = 25.9 kcal/mol)抵消。这些热力学参数解释了有利的非共价相互作用(焓变)克服了结合时分子动力学的损失(熵惩罚)。单肽、单DOTA、二肽和双DOTA的熵损失值均低于曲妥珠单抗(-TΔS分别=20.3、18.9、22.0和21.4 kcal/mol)。熵损失的减少导致了亲和度的增加，表明在非结合蛋白状态下分子动力学(构象波动)较低。许多研究表明，N-聚糖在Fc上缺乏岩藻糖（岩藻糖基化）会增强ADCC。为了弄清从肽偶联中获得的ADCC增强是否可以应用于利妥昔抗体，我们使用了岩藻糖基利妥昔单抗。使用Fut8敲除CHO细胞(称为“岩藻糖基”)制备利妥昔单抗。N-聚糖分析表明，制备的岩藻糖基不含可检测到的岩藻糖基化N-糖(图S3A,B)。随后将纯化的岩藻糖基与二价肽偶联（称为“岩藻糖基二肽”）。![]()
图1 多肽/DOTA偶联曲妥珠单抗的构建示意图
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图2 多肽/DOTA偶联曲妥珠单抗增强ADCC
通过人PBMC测定Raji细胞(CD20阳性细胞、靶细胞)的细胞死亡，定量利妥昔单抗、二肽、聚焦基和岩藻糖基二肽的ADCC。二肽和聚焦基样品的ADCC高于利妥昔单抗(图3A)。此外，岩藻糖基化通过增强其ADCC的岩藻糖基二肽通过肽偶联进一步增强。四参数logistic曲线拟合(EC50移位)在统计上无效，因为在共轭时最高值发生了变化。使用SPR测定利妥昔单抗、二肽、岩藻糖基和岩藻糖基二肽对人FcγRIIIa (CD16a) V158的亲和力(图3B)(表S1)。未偶联的利妥昔单抗与FcγRIIIa结合，KD为61.4 nM。与利妥昔单抗相比，二肽、岩藻糖基和岩藻糖基二肽的亲和力分别增加了5.6倍、22.0倍和56.3倍(图3C)。这些结果清楚地表明，由肽偶联获得的ADCC增强适用于岩藻糖基抗体。![]()
图3 聚焦基和/或肽偶联利妥昔单抗的ADCC增强
为了阐明ADCC增强的基本机制，我们详细地对Fc和短肽复合物的晶体结构进行了分析。未结合Fc、肽共轭Fc、Fc-FcγRIIIa复合物的晶体结构和结构叠加的比较如图所示(图4A)。正如文献中讨论的，当抗体结合到FcγRIIIa时，Fc结构打开。肽偶联Fc的结构是开放的，与FcγRIIIa结合结构非常接近。肽偶联Fc与FcγRIIIa复合物Fc的均方根偏差(RMSD)值仅为0.795 Å。因此，肽偶联诱导Fc处于制备(优化)的FcγRIIIa结合状态。仔细观察晶体结构有助于我们理解肽结合的作用。肽和Fc之间的主要相互作用残基如图4B所示。将相互作用残基的埋深表面积(BSA)计算值绘制出来(图4C,D)。多肽的高疏水性残基Val610和Trp611(按PDB结构编号)与Fc的疏水性残基Met252、Ile253、Met428和Tyr436相互作用。肽的Thr613和Fc的Asn434之间的氢键也有助于这种强结合。Cys602和Cys612之间的内部二硫键有助于肽的稳定。值得强调的是，该多肽与CH2和CH3结构域的残基形成的疏水区域有很强的相互作用。许多研究已经描述了Fc结构在水溶液中是构象的集合体。蛋白质的局部动力学行为也可以根据晶体结构的B因子或温度因子来解释。显示了未结合的Fc晶体结构和Fc与短肽复合物的b因子的振幅(图4E,F)。虽然这两种结构之间的B因子的确切比较是不可能的，因为这个因子是晶体结构固有的，可以安全地假设共轭肽限制了Fc的CH2域的结构变化。采用氢氘交换质谱(HDX-MS)分析来评估溶液中局部抗体动力学。绘制了Ser239 ~ Pro245、Pro245 ~ Arg255、Thr256 ~ Val266、Trp381 ~ Thr394、Met428 ~ Leu443 5个多肽的氘吸收曲线(图4G)(表S2)。肽/ DOTA偶联曲妥珠单抗的氘摄取低于曲妥珠单抗，表明Fc波动减少。此外，二价结合强化了这一效应。值得注意的是，从Pro245到Arg255的肽的氘摄取在肽/ DOTA偶联后显著减少，因为Lys248残基是直接偶联的。![]()
图4 肽/DOTA偶联曲妥珠单抗Fc的结构前景
用差示扫描量热法(DSC)分析肽/ DOTA偶联曲妥珠单抗的热稳定性。图5A-G表示了全长、Fab和Fc的变性热图。详细的DSC参数(Tonset, Tm，ΔH)如表S3所示。对于曲妥珠单抗Fc，在70℃和82℃检测到两个变性峰，分别对应于CH2和CH3域的变性。CH2变性峰减少，而单肽/单DOTA Fc的第二个峰增加，二肽/双DOTA Fc的变化更大。diDOTA Fc的Tm值显著高(88℃)。 [结论]
ADC是发展最快的生物制药药物，因为它们具有抗体的特异性和小分子药物的细胞毒性。然而，药物偶联往往会影响ADC的分子特性。如何高效、易于管理地开发ADC仍然是一个挑战。这些障碍限制了ADC的进一步发展。在此，我们寻求开发一种简单而有效的药物偶联方法，以保持ADC的分子特性。在这种方法中，三种成分-抗体，多肽和有效载荷-通过两个化学步骤结合。在第一偶联中，肽和抗体在温和的条件下迅速偶联。通过第二偶联，有效载荷通过点击反应与肽偶联。该方法具有一系列的优点。各种有效载荷可以与抗体结合，其数量可以控制。由于偶联反应具有高度的位点特异性，并且是自发进行的，因此抗体的结构修饰(如还原二硫键)是不必要的。因此，共轭反应产生了少量的副产物。常用于设计ADC的可切割连接物，如多肽连接物或二硫键连接物，在血清中进行解共轭，导致脱靶细胞毒性。![]()
图5 全长、Fab和肽/DOTA共轭Fc的DSC热图
相比之下，本研究中使用的胺类偶联剂具有高的稳定性和不可劈裂性。这种共轭方法将允许开发高效和易于管理的ADC。与非偶联曲妥珠单抗相比，肽/ DOTA偶联曲妥珠单抗表现出增强的ADCC。共轭曲妥珠单抗分子动力学(熵)的降低有助于增强对FcγRIIIa的亲和力。这一效应的机制是，共轭肽诱导Fc处于预先优化(精心准备)的FcγRIIIa结合状态，导致热力学上有利的结合。肽偶联引起的ADCC增强不会干扰岩藻糖基化的作用。已经深入研究了岩藻糖基抗体对 FcγRIIIa 的亲和力增加的机制。多项结构研究表明，FcγRIIIa中Asn162位点的N-聚糖和Fc中Tyr296的取向对这种作用很重要。偶联肽在结构上与FcγRIIIa中的N-糖和Fc中的Tyr296相距甚远。因此，可以合理地假设肽偶联和岩藻糖基化是独立有效的。除了岩藻糖基化之外，还开发了多种生物工程方法来增强治疗效果，例如突变（GASDALIE）、模数转换器和双特异性抗体。这种“基于分子动力学的抗体工程”为治疗性抗体的分子设计打开了另一扇窗。利用核磁共振、小角度X-射线散射、透射电子显微镜和分子动力学模拟等技术的研究表明，通过观察结构变化，Fc/抗体结构是一个动态整体。抗体的铰链区是这些动力学的枢纽。我们之前的研究表明，Fc N -聚糖通过与CH2和CH3界面的α-螺旋(P245-T256)相互作用来调节这些动力学。与之前的研究一致，肽与α-螺旋以及CH2和CH3之间的沟槽形成强烈的相互作用，起到“楔子”的作用，导致Fc动力学降低(图6)。这些研究的结果表明，α-螺旋支配着抗体动力学。降低的Fc动力学有助于阻断变性，导致热稳定性增加。由于其高度的灵活性，CH2结构域是一个聚集倾向区域，而将CH2的疏水残基暴露于溶剂中是抗体变性的初始步骤之一。Yang等对Fc稳定化的研究进行了综述。diDOTA Fc的Tm为88°C，表明这是通过抗体工程实现Fc稳定的前所未有的结果。同时，单肽与FcRn的亲和力降低，二肽与FcRn没有结合(数据未显示)，可能是因为肽与FcRn的结合位点重叠。因此，FcRn抗体亲和力的降低导致血清在体内的半衰期缩短，并使其在患者体内快速清除。为了提高肽偶联抗体的治疗效果，需要另一种方法和/或进一步的工程来延长血清的半衰期。在放射性同位素(RI)偶联抗体治疗的情况下，应消除患者的RI抗体，以避免辐射暴露。因此，我们可以选择单共轭或双共轭，而这取决于预期的作用模式。总之，这种肽偶联方法不仅适用于药物偶联，而且适用于增强治疗性抗体以增强ADCC和稳定性。通过进一步优化，该技术有望应用于更广泛的治疗性抗体。原文出处
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41598-023-43431-0
DOI号：10.1038/s41598-023-43431-0
