Clark:典型(canonical)结构决定残基对抗体亲和力和稳定性的影响

学术   2024-11-06 17:53   北京  

摘要:本研究对抗VLA1单克隆抗体AQC2(Fab片段)的轻链和重链核心残基进行了一系列重新设计,旨在探究这些改变对亲和力和稳定性的影响。突变的位点主要位于CDR1区域、支撑loop环结构的残基,这些残基并不直接与抗原接触。采用基于结构的设计方法,参考或不参考共识序列信息,共设计了30个变体,其中24个成功表达。采用共识序列信息的设计中有70%保持了结合亲和力。虽然一些更极端设计在维持稳定性方面表现出意外容忍度,但这常以牺牲结合亲和力和可能的loop环构象变化为代价。研究发现,稳定性的降低与亲和力的减少存在显著关联,与预期的抗原结合表面需保持有序一致。核心区域过度拥挤(overpacking)倾向于降低抗体稳定性,建议避免此类设计策略。

【引

蛋白质-蛋白质相互作用界面,在细胞信号传导、细胞间通信及特定生物学领域如免疫学中扮演关键角色。适应性免疫系统中,中和抗体的产生对抵抗感染至关重要,其抗原结合主要通过抗体可变区实现。未成熟B细胞受体通过体内进化,即体细胞超变,选择亲和力更高的抗体。随后在成熟过程中,这些抗体可变区重组其他domain后,可重新表达并最终以可溶性抗体形式分泌。    

抗体的抗原识别界面由六个高度可变的loop环组成,这些环位于可变区结构域上,并由第二层更保守的称为“典型”或“框架区”残基支撑。这些框架区残基对抗体的结合亲和力和稳定性有着重要影响,是本研究的焦点。亲和力成熟过程中,特定B细胞受体上互补决定区(CDR)的氨基酸可能发生显著变化,已有研究报道了了这些核心支撑或典型残基在形成识别抗原loop环中的作用。特定位置的氨基酸种类鉴定通常与形成特殊的典型loop结构相关。这些规则在抗体人源化设计是尤其有用。

界面上的突变作用常不可预测,通常破坏界面降低亲和力容易,而提高亲和力则困难。在某些情况下,第二层次(Second sphere)的突变可能是一种替代路径,它可通过调节loop环形构象变化来增加亲和力,已有研究指出这类突变可对结合产生重要间接效应。Cooperative mutations partially involvingthe second sphere of residues can be important。举例来讲,Midelfort的研究表明四个氨基酸的团簇在抗体亲和力从nm水平进化到pm水平时有重要的协同作用。骨架移动可能在抗体序列空间更紧密的结合方面也是必要的。

本文作者早期开展了一项研究,内容是关于AQC2抗体和VLA1抗原结合表面氨基酸突变的作用。除了关键的金属结合残基,抗体界面的每个残基都进行了突变,经常是每个位置尝试几个逻辑性结构突变。研究表明中等程度的亲和力提升可以达到,晶体结构提示了几种亲和力提升的原因包括亚界面的重排。后来又尝试了增长L1loop,但也需要改变第二层次残基。

本工作旨在回答两个问题:(1)改变构成CDR核心的残基是否可以保持或提高稳定性和亲和力?(2)改变这些残基时,亲和力与抗体稳定性之间的关系如何?这些见解将为抗体及蛋白质-蛋白质界面设计提供指导。

【结果】

选择了两个埋藏残基簇,分别位于每个可变区的顶端。这些簇构成了支撑与抗原接触的CDR环残基核心的一部分。它们在结构上保守,但并不形成关键的氢键或离子对。如图1所示,每个核心内的相互作用主要是疏水作用力。轻链核心由四个野生型残基A25、V29、M32和Y70(Kabat系统中的残基25、27d、33和71)组成。重链核心由三个野生型残基A24、F29和M34(Kabat系统中的残基25、30和35)组成。在AHO编号系统中,轻链和重链的核心残基集分别为25、31、41、89和25、31、41。    

图1 野生型重链(左,蓝色)和轻链(右,绿色)典型核心结构。选择残基位置是因为它们形成了一个接触疏水残基簇。上面可以看到一小部分抗原(红色)。

重设计基于两大原则进行。首先,本研究探索了在已报告抗体序列中未曾发现的3至4个残基位置的新变异,这些新变异涉及核心残基组合,其配置超越了已知天然抗体中有效的排列。第二,设计偏向于采用已知序列信息,采用在特定设计位置常见的残基或其组合,遵循传统的设计方法。因此,根据这两种理念,设计被归类为“新颖”或“保守”,如表1所示。采用序列信息的设计中,70%保持了结合亲和力,而“新颖”设计中保持亲和力的比例明显较低    

表1 基于亲和性和稳定性数据的设计团队构建的规范核心变体的总结。简写的3或4个字母的代码是用大写字母表示突变的核心残基序列。KinExA列为野生型Kd /突变型Kd的比值。NB =未检测到。


图2 测量了所有变体的相对结合亲和力作为热稳定性(Tm)的函数。核心残基的3或4个字母代码用大写表示突变。

图2揭示了变体稳定性与亲和力之间的显著相关性。随着稳定性的降低,其结合亲和力亦随之减弱。所研究的所有变体相比于野生型均展现出降低的热稳定性,这一发现符合预期,考虑到抗体框架区结构经自然选择已达到优化状态。部分设计仍保持了原有的结合亲和力(图示顶端数据),其中大部分为保守设计,即采用了在已知序列中常见的核心残基组合。    

尽管较不稳定的变体往往结合较弱,但与线性的偏差是值得注意的。与野生型相比,熔点(Tm)可以下降大约3℃而不丧失结合亲和力。然而,类似的Tm下降至77℃也可能将亲和力降低超过一个数量级(比较Vvmy与aTmy)。显然,即使在同一个环中,支撑残基突变的微小差异也可能对环的构象和结合亲和力有着截然不同的影响。

图3展示了两种在保持结合亲和力方面表现最佳的重链新设计。其中一种是aWF,通过使用色氨酸来改变芳香族苯丙氨酸在核心的位置并增加包装密度。第二种是SHF,旨在通过新的丝氨酸和组氨酸残基在核心之间引入一个氢键。这两种都是与Fab的野生型核心有着显著偏离的设计。图4探索了核心中重原子数量与Fab焓稳定性之间的趋势。重原子的数量是指定义的核心残基侧链上的非氢原子数量。这个数字是核心包装密度的代理指标。大多数设计增加了密度,并倾向于破坏Fab的稳定性。就结合亲和力和稳定性的比较而言,有一些值得注意的异常情况。轻链设计aFmV和HvTy以及重链核心设计FMF与预期的趋势偏离,比预期的更不稳定。    

图3 两例模型的核心设计新颖。SHF设计在核心中包含一个氢键,而AWF设计是一个尚未在天然抗体中观察到的核心。这两种设计都破坏了Fab的稳定性,但保持了大部分的结合亲和力。

图4 测得的DSC展开焓热与两个标准核中重原子数的关系。大多数设计具有比野生型轻(avmy)或重(afm)规范核心更多的重原子,并导致不稳定。轻变量和重变量的线性拟合r平方值分别为0.61和0.51。弱结合轻链变异(FvIy和aFmV)已从拟合中排除。

讨论

本研究结果允许我们探讨骨架残基突变时结合亲和力与稳定性之间的相互关系。所选突变位置的侧链并未直接与抗原接触,而是构成了抗原接触环侧链的支撑和填充核心。引言中提出的问题关注这些核心残基的变化范围及其对结合亲和力和稳定性的影响。基于保守序列共识的设计显示出高度耐受,允许实现先前未见的核心残基组合。结果展示了稳定性与结合亲和力间的联系,发现稳定性较低的Fab分子通常展现出较低的结合亲和力。这种减弱可能源于环位置的不稳定或波动,或由于突变导致环构象偏离有利于结合的状态。    

其中aWA突变体的熔点接近野生型,但结合能力却显著降低,这一变体显著地揭示了环构象变化对亲和力变化的影响。可能的解释是,位于H3环基部的M34A突变破坏了关键的抗原接触环构象,进而影响了与抗原侧的金属结合,这种结合对亲和力的贡献可高达100倍。

该研究结果具有一定的实际应用价值。例如,通过改变核心残基,可以在去免疫化过程中调整抗体以避免T细胞表位。核心突变还可用于调节亲和力。虽然在体细胞超变异过程中研究的抗体核心未变,自然选择过程确实可以改变核心残基。与结合表面突变相比,核心突变可能更温和、更安全,因为它们不暴露于表面,较不可能增加免疫反应。设计策略应避免过度包装核心,以免破坏Fab稳定性。

结论

通过对轻链和重链支持核心的重新设计,本研究证实了突变如何影响抗体的结合亲和力和稳定性。在公开数据中,针对同一变体的联合亲和力和稳定性测量较为罕见,这些数据构成了计算方法开发的优质训练集。从数据来看,破坏Fab的结合环和/或核心的过度包装常导致亲和力降低。同时,研究结果展示了在保持亲和力和稳定性的同时,如何通过显著改变核心序列、疏水性和氢键作用来实现结构优化。因此,结合结构模型与已知抗体序列数据的综合方法是最为有效的策略。    

【原文出处】

Clark LA, Demarest SJ, Eldredge J, et al. Influence of canonical structure determining residues on antibody affinity and stability. J Struct Biol. 2014;185(2):223-227. doi:10.1016/j.jsb.2013.08.009

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.jsb.2013.08.009

指导教师:王战辉

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分享中国农业大学沈建忠院士团队王战辉教授课题组抗菌药物环境污染物、激素等小分子化合物半抗原设计、单克隆抗体发现和进化、免疫传感原理和构建、免疫检测技术及产品研发等方面的研究进展。联系方式:zhanhui.wang@foxmail.com
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