【摘要】
该研究开发了一种新型均相非竞争性免疫分析法，可以实现对HT-2毒素的一步法快速检测。该研究首先构建Fab噬菌体展示库，从中筛选出特异性识别HT-2毒素的Fab片段，并与荧光供体相连。在人初始单链可变片段噬菌体展示库中筛选出抗HT-2免疫复合物抗体，并与荧光受体相连接。最终构建了以均相荧光共振能量转移技术为基础的非竞争性免疫分析方法。结果显示，该方法特异性良好，与T-2毒素交叉反应率小于10%。灵敏度高，半数抑制浓度值为9.6 ng/mL，检测限为0.38 ng/mL。检测时间短，样品加入后10分钟即可获得读数。该方法为HT-2毒素的检测提供了一种快速、灵敏且特异的手段，在食品安全、环境监测和农业研究等领域具有广泛的应用前景。
【引言】
HT-2毒素是一种由镰刀菌产生的次生代谢产物，属于单端孢霉烯族化合物，是一种危害严重的食品污染物。它广泛存在于谷物、饲料和食品中，对动物和人类健康构成严重威胁。摄入被HT-2毒素污染的食品可能导致呕吐、腹泻、拒食、体重下降以及免疫抑制等多种健康问题。因此，开发一种快速、准确、高特异性的HT-2毒素检测方法对于保障食品安全和人类健康具有重要意义。
非竞争性免疫分析法与竞争性免疫分析法相比，往往具有更佳的灵敏度、动力学和线性范围。对于霉菌毒素等小分子而言，由于没有多个表位可以同时结合两种抗体，所以不能直接构建双抗体夹心检测方法。此时使用识别由第一抗体和小分子分析物形成的免疫复合物的抗体，是目前为止实现非竞争性免疫分析方法的重要途径之一。通过免疫接种方法制备抗免疫复合物抗体，依赖免疫复合物的稳定性，导致其成功率较低。而利用噬菌体展示抗体库技术可以以较高的成功率获得针对免疫复合物的抗体。
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）是一种基于荧光共振能量转移原理的分子间相互作用检测方法。供体荧光分子的能量被激发到高能态，然后通过分子间的偶极-偶极耦合作用转移到受体荧光分子。这种现象仅当供体和受体彼此足够接近（1-10 nm）且供体和受体的荧光光谱相匹配时才会发生。Fab抗体片段的大小非常适合建立TR-FRET分析方法。
本文的研究目的是利用噬菌体展示抗体库技术分别制备抗HT-2和抗HT-2免疫复合物的Fab抗体，利用该配对抗体，建立一种特异性高、灵敏度高、检测时间短的一步均相免疫分析法，用于检测HT-2毒素（图1）。
1. HT-2毒素偶联物的制备与验证
2.抗体基因库的构建
使用HT-2毒素-软体动物血蓝蛋白偶联物免疫小鼠。取对HT-2毒素免疫反应最佳的小鼠的脾脏提取总RNA反转录为DNA，用针对重链和轻链可变区和恒定区的特异性引物扩增小鼠IgG轻链和重链，最终构建了抗体片段（Fab）噬菌体展示库。通过测序20个Fab克隆确定该抗体库的大小为6×107μg−1DNA。
3.抗HT-2毒素抗体的开发与特异性验证
4.抗免疫复合物抗体的开发
图2 利用竞争性ELISA测试交叉反应及竞争法与非竞争法灵敏度对比
5. TR-FRET检测方法的构建
图3 TR-FRET检测原理示意图
6. TR-FRET检测方法性能评估
通过向小麦空白样品提取物中分别添加了1-100 ng/mL浓度的HT-2毒素和T-2毒素标准品。结果在1-100 ng/mL的浓度范围内，未观察到与T-2毒素的可检测交叉反应（见图4），表明所建立方法特异性良好。
图4 TR-FRET检测方法特异性评估
为了评估基质影响，该研究分别利用PBS和7%甲醇-PBS溶液中添加了5至100 ng/mL浓度的HT-2毒素。结果表明甲醇可干扰荧光检测值。此外还通过对比不同浓度的真实提取样本和对应浓度的空白小麦样品提取物添加证实了小麦的提取基质会降低测定响应值，需要使用基于小麦基质的标准曲线进行测试。
图5 TR-FRET检测方法基质影响评估
为评估方法灵敏度，该研究利用公式：LOD= 空白平均值 + [3×空白标准偏差]；LOQ = 空白平均值+ [10 × 空白标准偏差]。计算出该方法的LOD和LOQ分别为0.38 ng/mL和1.1 ng/mL，线性范围为25-400 μg/kg。其灵敏度与之前报道的结果相近。
为评估方法的准确度与精密度，该研究在25-400 μg/kg的浓度范围内进行了参考样本的测试，结果小麦基质中HT-2毒素的回收率和变异系数（CV%）均表现良好（图6）。
图6 TR-FRET检测方法准确度与精密度评估
【总结】
该研究成功开发了一种基于TR-FRET技术的非竞争性免疫分析方法用于快速检测HT-2毒素。该方法利用重组Fab片段构建夹心结构，通过测量荧光信号的强度实现对HT-2毒素的定量检测。实验结果显示，该方法具有较高的灵敏度、准确性及特异性，在小麦基质中对HT-2毒素的检测限较低，且在25-400 μg/kg的浓度范围内表现出良好的线性关系和重现性。该方法有望为HT-2毒素的快速检测提供一种新的解决方案。
【原文出处】
Henri O. Arola, Antti Tullila, Harri Kiljunen, Katrina Campbell, Harri Siitari, Tarja K. Nevanen.Specific Noncompetitive Immunoassay for HT‑2 Mycotoxin Detection[J].Analytical Chemistry, 2016, 88, 2446−2452.
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5b04591
