摘要:抗体在诊断、治疗、疫苗以及预防等卫生领域扮演着极为重要的作用。单克隆抗体则因其具备高度特异性、识别单一表位以及可大量生产等特性作为生物传感器广泛应用于多种免疫分析方法中。该综述总结了多层面的抗体纯化技术以及运用单抗的相关免疫分析技术。
关键词:单克隆抗体;传统诊断工具;生物传感器;侧流免疫层析方法;应用;
【图解摘要】
【引言】
免疫系统为保护生物体的各个系统免受入侵者或病原体的侵害而不断地在进化和发展,这是生物体固有的天然机制,而免疫系统正是通过产生微观分子——抗体分子来发挥这一机制的。由于具有高度的特异性和选择性等显著特点,抗体被广泛应用于诊断、治疗、预防等各个领域。抗体分为两大类,即单克隆抗体和多克隆抗体。多克隆抗体是一组异质抗体分子的集合,它们都针对免疫原上的特定表位。而实验室生产的单克隆抗体(mAbs)则是一种被设计用来替代免疫系统中传统抗体的分子,这类免疫球蛋白可能会识别并靶向抗原上的特定表位。单克隆抗体被用于诊断和治疗多种人类疾病,如疟疾、阿尔茨海默症、癌症以及其他许多疾病。单克隆抗体还可通过化学工程来实现增强效能和效用。由于具有对靶标更敏感和特异等优点,单克隆抗体比多克隆抗体更受欢迎。其次,单克隆抗体可以通过杂交瘤技术大规模生产,这是单克隆抗体生产的一个独特优势,且使用杂交瘤技术还可以产生针对多种分析物/靶标的特异性抗体。故而单克隆抗体是制药工业有前途的候选者。目前已有多种常规诊断方法依赖于单克隆抗体,例如流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹(Western blot)、免疫荧光染色(IFA)和免疫组织化学(IHC)等。这些传统方法使用了单克隆抗体并显示出显著的响应效应。
此外,单克隆抗体被用于各种其他即时检测设备,如电化学传感器和胶体金免疫层析法(LFI)。单克隆抗体在资源有限的环境中用于即时检测设备的研究。这篇综述讨论了所有常规的使用单克隆抗体的方法以及相关的先进方法,并概述用于制造生物传感器的免疫固定技术,同时总结各种类型的生物传感器,从依赖仪器的传感器到无需仪器的传感器。
1.免疫系统与单克隆抗体
免疫系统分为两类,即先天性免疫和获得性免疫。先天性免疫系统是我们身体的防护屏障,可以立即保护身体免受外来入侵者的侵害,例如中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞等。获得性免疫系统则更为复杂,它首先识别外来入侵者,然后产生大量分子(Ig)来对抗该病原体。这种免疫能力负责产生记忆细胞,如果病原体再次遇到宿主身体系统,记忆细胞会放大响应。由这种记忆产生的抗体或免疫球蛋白包括Ig M、Ig D、Ig G和Ig A。抗体的结构分为两部分,即抗原结合片段(Fab)和另一恒定区域(Fc)。抗体因其具有更好的选择性和灵敏度,因而被广泛用作诊断分子。mAbs技术改变了诊断时代,并用于各种体外诊断应用。单克隆抗体可由杂交瘤技术产生的,与多克隆抗体相比,单克隆抗体具有许多优势,因为单克隆抗体是由杂交瘤技术产生的细胞系产生的。由于可以产生不死细胞系和具有特定抗原特性的抗体,因而单克隆抗体可以大量生产。
2.单克隆抗体纯化与量产所涉及之工序
抗体纯化过程涉及到多种色谱技术,如蛋白质A色谱技术往往用于捕获抗体。在这种技术中,用于产生抗体的培养细胞经过离心后,其上清液被加载到蛋白质A柱上,随后为去除吸附在固定相上的杂质,柱子用平衡缓冲液清洗,紧接着用低pH缓冲液进行抗体的洗脱。在完全洗脱单克隆抗体后,最后柱子用0.1 M NaOH清洗。蛋白质色谱是一种常用的技术,用于产生高度纯化的单克隆抗体,并且可以很容易地与其他色谱技术结合用于进一步放大。而由于单克隆抗体的分子量较大,则可通过大小排阻色谱轻松地将其与小分子分离。然而,由于该技术的生产率较低,因此并不优于蛋白质A色谱技术,但在生产率不是问题时可以使用该技术。在这种色谱法中使用了硅基柱,并且在高pH值下不应清洗。另一种用于诊断的色谱技术是相互作用色谱。在这种方法中,单克隆抗体被纯化,因为聚集体比单体蛋白质更疏水。然而,由于需要较高的盐浓度来结合,该方法并不适用于单克隆抗体的纯化。因此,上述技术与离子交换相结合,有助于去除杂质。这种技术称为多模态色谱(MMC)。而若需获得最佳效果,则pH值和离子强度都需要优化。
将各种色谱技术结合起来可以克服单个技术的局限性,并产生具有商业可行性的产品。由于各种干预措施和研究,mAbs被转化为治疗方案。mAbs被引入并批准用于治疗目的且广泛用于疾病的诊断。快速诊断和及时管理疾病可以挽救许多生命。生物传感器已经改变了资源有限环境下的即时诊断时代。在生物传感器中,采用了各种生物识别技术,其中,抗体被用于检测多种分析物。如在生物传感器的设计中便使用单克隆抗体,其具有灵敏度、特异性等优点,避免了交叉反应,从而限制了假阳性结果的出现。这些抗体通过使用如共价、非共价和亲和性基团等各种连接方式而被沉积在工作电极表面。
非共价固定抗体主要依靠静电、疏水和范德华力。吸附法通过物理或化学吸附实现,但存在稳定性和方向性问题。新开发的固定格式(NIF)方法通过将抗体溶解在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)中,形成稳定复合物吸附在微量滴定板(MTP)上,简化了ELISA检测方法。共价固定则通过引入功能基团与抗体形成共价键,提高稳定性和精确性。例如,使用二醛功能化离子液体固定抗体,提高了传感器导电性和灵敏度。聚合物聚(2-氨基苯乙胺)附着在电极上,用于检测免疫球蛋白,表现出良好的线性响应和低检测限。此外,巯基共价结合提供了定义的定向和均匀结合,增强了抗原-抗体结合,提高了生物传感器的选择性和灵敏度。基于亲和力的固定,如生物素-亲和素系统,也因其高结合能力和特异性而受到青睐。这些方法为开发高性能生物传感器提供了多种途径。
3.传统方法
本部分主要介绍常见的基于单克隆抗体的免疫诊断方法。
3.1 Western Immunoblotting(WB)
WB技术旨在于混合蛋白质中检测出某一特定的蛋白质。在这种技术中,通过毛细作用(如图1所示)将蛋白质从凝胶转移到膜上。该技术在诊断中被广泛应用,因为在抗体偶联后,它能够检测组织匀浆中的特定蛋白质。当无法进行病原体培养时,免疫印迹法(WB)扮演着重要的角色。在一项研究中,开发了一种检测主要心内膜炎致病菌(即金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、链球菌和厌氧链球菌)的诊断方法。采用WB法对上述物种的抗原轮廓进行分类,仅有金黄色葡萄球菌和链球菌显示出交叉反应。上述方法用于检测粪肠球菌和厌氧链球菌。WB非常适用于检测蛋白质,而在该技术中,需要使用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)对凝胶中的蛋白质进行分离。
图1:检测抗原示意图,图中显示膜上含有转移蛋白、一抗、酶偶联二抗和酶底物。
3.2 ELISA(酶联免疫吸附试验)
ELISA技术广泛应用于检测抗原、蛋白质、抗体和糖蛋白,通过抗原/抗体在固体载体上的沉积和结合产生颜色变化(如图2)。该技术已用于检测牛白血病病毒(BLV),其中单克隆抗体针对包膜糖蛋白和结构蛋白,优化后的检测方法比传统ELISA更经济,适用于牛奶和血清样本,且可自动化。此外,基于ELISA的登革热诊断方法被开发用于疫苗接种前筛查,使用登革热免疫球蛋白G单克隆抗体,尽管对日本脑炎病毒(JEV)有轻微交叉反应,但该方法对血清样本的诊断具有高度选择性和特异性。
在乳腺癌检测方面,ELISA方法通过两种单克隆抗体检测HER2 ECD水平,展现了高敏感性和特异性,尤其对含有曲妥珠单抗的样本。在食品安全领域,制备的单克隆抗体用于检测食品中的葡萄球菌肠毒素,固定在酶免疫分析板上的检测平台提供了一种特异性和定量的检测方法,实际应用于血清和液体食品样本,且对工程毒素具有高度特异性,未显示与其他葡萄球菌肠毒素的交叉反应。这些应用展示了ELISA技术在疾病诊断和食品安全检测中的多样化和有效性。
图2:ELISA检测抗原的示意图,显示直接,间接和夹心检测模式,一抗,捕获抗体酶偶联二抗和酶底物。
3.3 Immunofluorescence Test(免疫荧光试验)
该技术用于诊断抗体(Ab)和抗原(Ag)的结合,而后在荧光显微镜下读取结合,就像抗人IgG抗体附着在荧光染料上一样,而该方法具有确定数量的能力。最近,作者开发了一种检测冠状病毒的方法,该方法使用横向流动条带在不到1 h的时间内检测RNA。其利用DNA探针结合冠状病毒的保守区域,然后使用基于荧光色的抗体将DNA-RNA杂交结合。该方法经济且可自动化,并可在临床即时检测中使用。
4. 生物传感方法及单克隆抗体在生物传感器中的应用
4.1 生物传感器之概念
生物传感器由生物识别元件、传感器或转导元件以及信号处理器组成。生物识别元件如酶、核酸、细胞、抗体和抗原,对分析物具有高度特异性和敏感性,能将化学能转化为可检测的信号。转导元件包括电化学、光学、压电等类型,负责感应生物识别元件与分析物的相互作用。信号处理器则用于可视化信号。
生物传感器的设计需考虑线性度、检测限、灵敏度和特异性等定性参数,这些参数影响其监测能力。检测限(LOD)是衡量传感器准确性的关键指标,其值越低,传感器的实用性越高。稳定性和可重复性也至关重要,因为生物识别元件的特性和环境条件都会影响传感器性能。免疫传感器因其高特异性和灵敏度,在诊断领域具有显著优势,而具备多种优良特性的单克隆抗体之应用进一步改善了诊断准确性。
4.2 不同类型的生物传感器
根据其原理,生物传感器有多种选择,例如电化学生物传感器、比色生物传感器、侧向层析测定生物传感器等等。本节总述了多种基于单克隆抗体的生物传感器方法。
【Electrochemical Immunosensors(电化学免疫传感器)】
这是目前流行的电化学生物传感器类别之一,这种类型的生物传感器抗体被用作生物识别元件,对其目标具有出色的选择性。图3显示了采用有效单克隆抗体的电化学免疫传感器的图像。
单克隆抗体在多种免疫传感器中发挥关键作用,用于检测包括农药、癌症标志物、毒素和病原体在内的多种分析物。一种基于单克隆抗体的电化学免疫传感器被用于检测吡虫啉,通过丝网印刷电极实现,具有广泛的线性变化、低检测限和快速检测时间。石墨烯量子点和金纳米棒增强的电极用于前列腺特异性抗原(PSA)的检测,采用核酸适配体和抗体作为生物识别元件,展现了良好的稳定性和效果。
在食品安全领域,单克隆抗体被用于开发灵敏的免疫传感器,如通过生物素与抗赭曲霉毒素单克隆抗体偶联形成的亲和素-生物素复合物,以及用于检测四环素类的电化学免疫传感器,后者利用羧基修饰的铁纳米颗粒和壳聚糖增强信号。此外,微型叉指微电极上的免疫传感器用于检测毒死蜱,展现了良好的特异性和敏感性。
在疾病诊断方面,单克隆抗体被用于检测血凝素抗体(HA)、癌胚抗原(CEA)和淀粉样蛋白β 1-42(A-1-42),后者用于阿尔茨海默病的检测。这些传感器在皮摩尔水平上显示出良好的灵敏度和特异性。例如,基于金芯片的生物传感器通过自组装单层固定抗体,用于CEA的检测,展现了由于抗原与抗体结合引起的信号差异。
这些免疫传感器在实际样品中的应用证明了它们的潜力,如在预处理小麦样品中检测赭曲霉毒素,以及在牛奶样品中检测四环素类。它们在疾病诊断和早期检测方面展现出巨大的前景,具有高灵敏度、快速、特异性和稳定性。此外,这些传感器的设计考虑了环境条件(如温度、盐浓度、pH等)的影响,以确保在不同条件下的稳定性和重复性。
图3:基于单抗的电化学免疫传感器图解
【Colorimetric Immunosensor(比色免疫传感器)】
比色生物传感器使用技术来确定指定样品中有色成分的浓度。使用比色生物传感器对物质的诊断基于对颜色变化的目视来测定以及与参考颜色的比较(图4)。He等研究人员开发了基于单克隆抗体的比色免疫传感器,检测SARS-CoV-2刺突蛋白的LOD为0.037 μg/mL。该传感器通过基因改造酵母表面,结合美洲驼衍生的纳米抗体,创建了全细胞生物传感器,利用金纳米颗粒(GNP)功能化增强敏感性。在SARS-CoV-2刺突蛋白存在时,形成夹心结合结构,通过HRP和比色底物产生比色指示剂,展现了高灵敏度。
Byzova等人开发了基于单克隆抗体的比色生物传感器,用于诊断LPS和Francisella tularensis(弗朗西斯菌),其方法的LOD分别为40 ng/mL和3×10^4 CFU/mL。该传感器使用GNP,通过抗LPS单克隆抗体包被,通过抗原相互作用导致颜色变化,530 nm处的光度测试揭示分析物的出现。测试表明,平均直径为34 nm的AuNPs效果最佳,该方法结合了灵敏度和速度,可区分不同土拉菌株,已用于水样中目标的检测,不影响敏感性。这些比色生物传感器为快速、灵敏的病原体检测提供了新途径。
图4:基于单抗的比色免疫传感器图解
【Lateral Flow Immunoassay Biosensor (测流免疫层析传感器,LFIAB)】
1956 年,(半定量)试纸条首次用于检测到尿液中的葡萄糖。怀孕套件是 LFA 最受欢迎的应用程序之一。这种检测是不需要任何专业设备、知识或经验的设备示例(图5)。测流层析(LFA)生物传感器为消费者提供了一种简便、经济的检测方法。样品首先放置在样品垫上,然后通过共轭垫传递至膜,膜上设有测试和控制线。最后,样品被吸收到吸收垫中,完成流动。孵育后,垫上显示的单线结果表明测试的阳性或阴性。
这种技术常用于基于抗体以及核酸适配体的生物材料识别,尤其是单克隆抗体,它在LFA诊断领域尤为重要。例如,Lu等人利用小鼠杂交瘤程序生成的单克隆抗体开发了一种LFA,用于检测SARS-CoV-2变体,其对纯化NP的LOD为8 pg,对真实病毒的LOD为625 TCID50/mL。该试纸条对多种冠状病毒株和其他呼吸道感染无反应,能鉴定包括alpha、beta、gamma和delta在内的多个变体。
另一项研究中,Hnasko等人使用杂交瘤方法开发的单克隆抗体,通过侧向层析免疫测定法在5分钟内检测食品中的麸质,LOD为150 ng/mL。这些单克隆抗体通过FPLC分离,并在中性pH值下从培养基中纯化。所有产生的抗体均为IgG1亚类,具有κ轻链。
这些单克隆抗体被用于构建基于GNP的LFIA,用于即插即用的试纸系统,以识别麸质。通过一系列评估,证明了这些麦醇溶蛋白单克隆抗体的结合能力,并提供了一种快速、便捷的检测方法。这些研究展示了LFA生物传感器在疾病诊断和食品安全检测中的潜力和应用。
图5:基于单抗的测流层析免疫分析(LFIA)图解
【结论】
单克隆抗体在诊断中起着至关重要的作用,但亦存在一些挑战,例如选择针对特定抗原的单克隆抗体,这是一个耗时且困难的过程。使用单克隆抗体的传统方法包括ELISA、Western blotting和免疫荧光试验。这些试验具有各种优点,而耗时的性质和对专业知识的需求提升了其作为免疫传感器的要求。单克隆抗体广泛应用于免疫传感器中,这提高了创建的传感器的特异性和灵敏度。若通过将几种当前技术结合起来,如IoNT(物联网纳米技术)、无人机技术、机器人技术和智能手机技术,则单克隆抗体可在多种诊断平台上轻松适应。因此,将基于单克隆抗体的生物传感器与上述智能技术相结合,可以改善诊断,并有助于开发下一代诊断仪器,以惠及消费者,使其在价格、有效性和智能检测方面受益。
指导教师:王战辉
文献出处:Malhotra, N., Chahal, A., Jain, A. et al. Monoclonal Antibodies: Purification, Application in Conventional Methods and Cutting Edge Technology. Biomedical Materials & Devices (2024). https://doi.org/10.1007/s44174-024-00203-2。
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