【引言】
截至2024年5月，美国食品和药物管理局（FDA）已批准的127种抗体，用于治疗免疫疾病和癌症等疾病。尽管这些抗体中大约80%是经典的全长单克隆抗体（mAbs），但与标准化的免疫球蛋白相比，工程化抗体可能产生分子量更小的抗体，具有潜在更广泛的应用，因此吸引了越来越多的关注。例如，抗体片段可开发成多特异性形式，能够靶向不同的分子或表位，这些片段可在简单的原核生物或酵母系统中表达，生产成本较低，而传统的mAbs则需要在哺乳动物细胞系中表达。此外，抗体片段由于扩散速率更快，可能在穿透组织时表现更好，如靶向实体瘤和用于眼部相关治疗。在开发针对中枢神经系统疾病（如阿尔茨海默症或帕金森症）药物时，抗体片段可穿过血脑屏障，具有更大的优势。
尽管抗体片段相较于传统的mAbs具有诸多优势，但其在FDA批准的抗体中所占的比例很小，双特异性抗体（bsAb）所占比例更少。工程化抗体开发的主要挑战之一是其稳定性较全长抗体低，可能是由于这些分子并非自然进化的结果。尽管全长mAbs的可开发性已经得到了广泛的研究，但对替代性工程抗体的可开发性的系统分析仍较为缺乏。
本研究中比较了针对肿瘤坏死因子（TNF）的64种不同抗体形式，涵盖了8种类型。随后测量了与活性、生产、短期物理属性和长期稳定性有关15种生物化学和生物物理特性，包括评估诱导表面不稳定性的界面应力测试。结果显示，天然全长抗体在稳定性方面表现优于工程抗体，而经过改造的工程抗体在本体和界面处都存在不成比例的碎片化和聚集。尽管如此，研究中也有一些工程抗体在稳定性上接近全长IgG抗体，本文提供了不同形式抗体可开发性的初步标准化排名。
【实验结果】
抗体库的特征
图1.本研究中使用的73种抗体结构的示意图。（抗体库由全IgGs、片段、双特异性和双特异性片段组成。）(HzATNP变体（Var1-Var9）之前已经描述过，它们已被用作本研究中的对照抗体组。双特异性抗体（IgG/biAb）的子集包括三种IgG（Var21、Var22和Var23），它们用作对照。除了结合ATNP的HzATNPs外，其余变体都靶向TNF-α)
本研究基于两个商业化抗体构建了完整的抗体库，即阿达木单抗（hIgG1）和赛妥珠单抗（hIgG1格式），它们均特异性结合肿瘤坏死因子（TNF）。该库包含11种常规IgG抗体、5种scFv化合物、11种串联scFv、8种二价抗体化合物、6种scFv-Fc-scFv化合物、4种scFv-Fc化合物、7种mAb-scFv化合物、4种scFv-Fc与一半抗体结合（scFv-Fc_HC_LC）以及8种双特异性抗体化合物HC1_LC1_HC2_LC2。通过对双特异性抗体化合物所生成的双表位分子进行评估，其双臂均可结合TNF。此外，还包括一个已被证实的广泛的溶解性潜力的基于抗半抗体的IgG4变体库控制组。在11种常规抗体中，差异源于可变区或Fc区内的单一突变。对于含有scFv的分子，产生scFv变体，有或没有稳定突变 （Adalimumab VH_R16G_D30S_S49G_S78T_Y101S） 并且有或没有插入稳定的二硫键（VH_44C-VL_100C）。对于需要 Fc 区异二聚化的化合物（如biscFv，Fab-scFv-Fc和biAb），引入Knob-in-Hole突变以促进正确的化合物组装。
在初始阶段评估生物物理特性
在初步发现阶段，该研究首先评估了64种抗体对TNF的结合能力，所有分子均表现出高的结合能力，证实了所有抗体形式的成功重排，其中scFv和scFv-scFv提升更为显著（图2a）。随后，该研究检测了Fc-FcRn的相互作用，这对于确保抗体在体内的长半衰期至关重要。FcRn可以使Fc区在细胞内化后得以回收。对于C-末端带有scFv的双特异性抗体变体，Fc区必须能够与FcRn受体结合。通过表面等离子体共振（SPR）分析，我们发现重新设计后的所有形式抗体在Fc-FcRn相互作用方面没有显著差异（图2b）。
图2抗体的生物物理特性。（以评估在发现的早期阶段评估的关键性质）。这些线表示一组分子内分子的平均值，虚线表示所有分子的平均值。绿色、黄色和红色背景分别表示良好、中等和不良。（下同）
本研究还测量了与大规模生产相关的纯度和可溶性聚集体的存在情况。通过尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC）比较不同分子的相对性能，发现双特异性抗体的纯度较低，由于额外的纯化步骤会增加成本并降低最终产量，因此这可能是双特异性抗体开发面临的挑战（图2c）。随后，该研究还对生物物理稳定性属性、长期稳定性、风险评估与计算开发性排名进行了评估。
生物物理稳定性
结果表明在高盐条件下，较复杂的工程化抗体如scFv-scFv和双特异性抗体相较于全长抗体则较易发生聚集和裂解；全长抗体在不同温度条件下显示出较好的稳定性，而工程化抗体片段和双特异性抗体在高温条件下同样容易发生聚集和裂解。本研究还为每种抗体分子分配了特定的标志，评估了哪些分子超过了某些生物物理属性的阈值。通过标志分布图可以看到，全长IgG抗体的开发风险最低，而双特异性抗体及抗体片段如scFv、biscFv/biscFv-Fc、scFv-scFv等构造则表现出较大的开发挑战（图3）。总体而言，传统的全长抗体的开发性最高，而双特异性抗体和串联片段的开发性较低。
图3 物理稳定性特性。热稳定性用熔化温度（Tm）和聚集开始温度（Tagg）表示，热稳定性用不同分子的自相互作用参数（kd）表示。
长期稳定性
最后，在4°C、30°C和40°C下孵育1年后，通过片段和聚集来评估整个文库的长期稳定性。采用SE-HPLC方法对残留单体、碎片、可溶性和不可溶性聚集体进行了评价。在4°C下没有观察到所有分子的变化。在30°C时，除scFv-scFv片段外，大多数变体在聚集方面都是稳定的，而一些分子有5-8%的片段（图4ac）。在40°C的加速条件下，观察到显著的聚集和片段，全长抗体的表现总体上优于片段和双特异性（图4d-f）。抗体片段的明显片段化很可能是由于GS连接器，可通过工程进行优化（例如通过调整连接器的长度或引入二硫键）或使用硅内建模来优化其灵活性。
图4 长期稳定性数据。在30°C和40°C孵育一年后，测定聚集体物（HMWP）、片段（LMWP）和完整单体（Mon）的百分比。
实验和计算的可发展性排名与标志风险的方法
为了进行定量比较，该研究为每个分子分配了一定数量的标志（定义为超过前几段描述的定量阈值的生物物理性质的数量），图5显示了不同分子组中标志分布的概述。每一组变体都展示了标志的分布，并且对于不同的格式存在显著差异。传统全长抗体的整体发育潜力较高，而双特异性和串联片段的整体发育潜力较低。其中，双特异性biAb和单抗-scFvbiAb以及片段scFv表现出中等的发育性，而双特异性biscFv/ biscFv-Fc、片段scFv-scFv和双特异性片段Fab-scFv-Fc和diAb格式显示出大量的标志。图6总结了每个抗体集分配给每个分析属性的总体标志。
图5 在不同抗体格式中标记变体的分布。绿色，黄色和红色框架表示各自变体集的整体可发展性风险
图6 基于生物物理性质的可开发性风险评估。（对整体可开发性风险有更多影响的分析方法是长期稳定性研究以及胶体稳定性和界面稳定性。双特异性片段和片段的发育性最差。）
【讨论】
除了用于临床试验的常规抗体外，更小的抗体结构也日益受到关注。本研究表明，替代性抗体结构在平均水平上比传统抗体更具不稳定性，尤其在聚集和裂解方面。与传统抗体相比，新型分子结构通常缺乏配套的实验数据支持。本研究填补了这一空白，为未来系统、定量的比较新兴结构提供了基础。结果表明，可开发性潜力依赖于抗体结构的不同设计，不稳定的抗体形式（如scFv Var36）可通过突变（如scFv Var38）或其他形式（如阿达木单抗IgG Var10-Var20）进行优化。
此外，目前尚不清楚针对全长抗体开发的计算机可开发性工具是否适用于其他抗体格式。本研究发现，尽管TAP（一个针对全长抗体的计算预测工具）在预测抗体衍生结构的可开发性问题上表现有限，但它在一定程度上与生物化学和生物物理测试结果一致。
综上所述，本研究通过测量15种生物物理属性，系统表征了73种不同形式的单克隆抗体的活性、生产、构象和胶体稳定性及其长期稳定性。通过设定各项生物物理属性的阈值进行定量比较整体上传统全长抗体表现出更高的开发潜力，而双特异性和串联片段结构的潜力较低。具体而言，双特异性biAb、mAb-scFv biAb和片段型scFv表现出中等开发性，而双特异性biscFv/biscFv-Fc、片段scFv-scFv及双特异性片段Fab-scFv-Fc和diAb结构则显示出大量不稳定标志。各性状间的相关性较差，且无单一性状可预测变体的长期稳定性。尽管全长抗体表现优于工程化变体，本研究强调某些结构几乎可达全长抗体的稳定性，并提供了各种形式抗体可开发性的初步标准化排名。
【原文出处】
Itzel Condado-Morales, Fabian Dingfelder, Isabel Waibel, Oliver M. Turnbull, Bhargav Patel, Zheng Cao, Jais Rose Bjelke, Susanne Nedergaard Grell, Anja Bennet, Alissa M. Hummer, Matthew I. J. Raybould, Charlotte M. Deane, Thomas Egebjerg, Nikolai Lorenzen & Paolo Arosio. A comparative study of the developability of full-length antibodies, fragments, and bispecific formats reveals higher stability risks for engineered constructs. mAbs, 16:1, 2403156.
https://doi.org/10.1080/19420862.2024.2403156
指导老师：王战辉 研究员
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