组织工程旨在通过利用生物材料和细胞来修复或替代受损的组织，并刺激生物体固有的再生潜能进行组织或功能的再生。然而，设计适合体内应用的生物材料仍然面临诸多挑战。理想的生物材料不仅需要具备良好的机械性能和生物相容性，还需要能够与机体内的周围组织动态整合，并在适当的时间内降解。水凝胶因其高含水量和柔软的特性，被广泛应用于药物递送、伤口敷料等领域。然而，以合成聚合物为原料合成的水凝胶在体内不均衡的降解速率或潜在的安全问题仍然是临床应用的主要障碍。天然聚合物制备的水凝胶因此成为组织过程材料的研究热点。
蛋清富含多种生物活性成分，如卵白蛋白、卵粘蛋白和溶菌酶等，这些成分具有良好的免疫调节能力和细胞吸收性。因此，蛋清被认为是一种有前途的生物材料。蛋清水凝胶因能够模拟细胞外基质而在体外细胞培养中具有潜力，然而，蛋白广泛自我交联形成的致密结构限制了其在体内应用的潜力。在实际体内生物实验过程中，这种致密结构导致了蛋清水凝胶在降解前无法与组织动态整合，表现出较差的组织整合能力和生物活性。
碳点的尺寸极小（小于10纳米），且表面官能团丰富，是极有希望作为连接剂与生物大分子或天然聚合物结合以创建新型超分子结构的候选材料。因此，为了克服上述限制，我们提出引入碳点作为引导蛋清蛋白肽链有序、均匀交联的策略。最近的研究已证实了将碳点掺入合成聚合物网络中可以略微提升合成水凝胶的机械性能。然而，在这些例子中，碳点并不作为主导交联剂，聚合物链可以在无碳点的情况下自行交联成水凝胶结构。另外，现有的研究尚未有针对蛋白肽链交联的有效方法。
基于以上背景，本课题组及合作团队对碳点交联蛋白水凝胶进行了合成研究。研究团队通过在稀释的蛋清溶液中引入碳点，成功制备了松散大孔的三维网状结构碳点交联蛋清水凝胶（CEWH）。碳点表面的官能团与蛋清肽链上裸露出的官能团以共价键和非共价键的方式结合，使得碳点作为锚点连接相邻的未折叠肽链，促进形成牢固的3D多孔网络结构。这种交联方式不仅改善了水凝胶的机械性能，还保留了蛋清自身的生物活性成分。体内生物实验也验证了CEWH作为组织工程材料的可行性。CEWH支架不会引发明显的免疫排斥反应，能够长期保持与周围组织之间的信息交换，为细胞生长、聚集和血管渗透创造了理想的支架。此外，CEWH在皮下植入后可有效调节微环境，招募巨噬细胞并促进其以M2表型持续增殖。结合CEWH与周围组织的长期动态交流，这种免疫环境的持续调节可有效促进机体毛囊再生和创伤愈合。
图1. CEWH合成路线图。
相关成果以“Carbon Dots Crosslinked Egg White Hydrogel for Tissue Engineering” 为题发表在Advanced Science上。通讯作者为澳门大学应用物理及材料工程研究院曲松楠教授,汤子康教授，健康科学学院邓初夏教授和刘子铭教授，第一作者为澳门大学博士后吴君，雷海鹏和博士生李墨馨。
首先根据我们之前的工作，柠檬酸和尿素通过溶剂热反应得到近红外碳点（CDs）。在高温加热下将稀释的蛋清与CDs水溶液混合，形成了透明、不流动的水凝胶 (CEWH)。所获得的CEWH同时具有蛋清和碳点的吸收特征峰，证明二者的充分混合。此外，CEWH的吸收带尾部延伸至近红外区域，这归因于水凝胶内部超分子结构的形成，从而导致光散射的增强。我们还注意到CEWH的荧光强度明显高于蛋清和碳点混合溶液的荧光强度。我们进一步推测，在凝胶化过程中与CDs 表面结合的热展开蛋白链阻碍了CDs与水分子之间的接触，从而阻止了水分子引起的能量耗散。
为了验证这一猜想，我们测量了圆二色光谱，以监测加热过程中蛋清蛋白的结构变化。正如预期，CDs本身没有显示任何圆二色性信号。纯蛋清溶液表现出强烈的圆二色性信号，这归因于其高含量的生物大分子和小分子。经过热处理后，CEWH相比于蛋清溶液直接加热得到的水凝胶，表现出更剧烈的圆二色性信号损失，这一证据表明CDs在加热过程中加剧了蛋白链的完全展开，从而形成不可逆的纳米连接水凝胶结构。
进一步地，为了研究CDs和蛋白肽链之间的连接方式，我们对样品进行了FT-IR和XPS测试。XPS结果与FT-IR结果相互验证。测试结果表明在加热蛋清和CDs混合溶液的过程中，蛋清蛋白展开，暴露出氨基、羰基和羧基等功能基团。然后，这些基团通过非共价键（分子间氢键）或共价键（脱水缩合反应）与CDs上的表面官能团结合。
此外，高弹性和较好的拉伸性使得大尺寸CEWH 贴片（20 厘米 × 15 厘米）能够舒适地粘附在人体皮肤上并承受日常运动产生的拉力范围，这也证明了CEWH作为人造皮肤敷料的有前途的生物材料的潜力。
图2. CEWH的物理特性表征。
为了全面评估了CEWH对细胞活力和细胞增殖的影响，我们在体外使用了三种细胞系L929、NIH3T3和MDA-MB-231分别测试了CEWH和CEWH渗出液的细胞毒性和细胞生长促进能力。用不同浓度的CEWH渗出液培养的L929和NIH3T3细胞在孵育48h后仍表现出高细胞存活率（> 80%），表明了较小的细胞毒性。此外，我们还在CEWH表面观察到了优异的细胞附着和增殖，在CEWH上培养的MDA-MB-231细胞密度在三天内显著增加。SEM图像显示细胞周围伸出了大量触手状结构附着在凝胶多孔网络上。
在确定了CEWH在体外促进细胞生长和增殖的能力后，我们采用皮下植入小鼠模型开始研究其在生物体内的相容性和降解性。根据CEWH的红色荧光信号，我们初步确定了其在体内降解加速开始的时间段（第16天），且降解可持续至少20天。进一步地，通过观察第21天切除的植入区域小鼠皮肤，我们发现，在植入后第14天炎症细胞大量浸润到CEWH植入物中，并且这些细胞在第21天继续在植入物内持续增殖。这些结果表明了CEWH在体内的降解时间。此外，我们还注意到CEWH可以很好地融入周围的皮肤组织，没有表现出过度炎症（如脓液形成等）。在植入区域，细小扭曲的新生血管在CEWH表面的组织纤维膜周围增生，甚至可以穿透组织纤维膜进入凝胶内部。综上所述，这些结果：1）表明了CEWH 可以充当机体内细胞生长和增殖的极佳支架；2）CDs连接蛋白肽链的方法不会增加蛋清的免疫原性，相反，它显着延长了蛋清衍生生物材料的体内降解速度，并使材料表现出充分的细胞和血管浸润，从而促进与周围组织的动态整合、物质交换和信息交流。
图3. CEWH的细胞毒性、体内降解率和生物相容性。
为了可视化这种动态交流引起的皮下免疫微环境变化，我们在LysM-Cre-mT/mG小鼠上建立了耳部植入模型。与正常皮肤区域相比，植入后第12天和第19天，在CEWH植入物周围观察到大量绿色荧光信号，表明CEWH内大量的巨噬细胞浸润。此外，我们观察到植入部位内的毛囊数量和大小也有明显增加。
图4. CEWH的免疫调节。
小鼠毛囊生长周期的生长期持续约2周，因此蛋清衍生的水凝胶（CEWH）可以满足与毛囊再生周期相匹配的材料降解和整合的需求。为了CEWH促进毛囊再生的假设，我们再次使用了皮下植入Balb/c小鼠模型。H&E和Masson三色染色结果显示，CEWH植入组的新生毛囊在第植入后第14天就出现在脂肪层附近，到第21天新生毛囊数目在增厚的皮下脂肪层中继续增加。即使在第28天CEWH完全降解后，毛囊的数量和生长深度仍持续存在并继续增加。这一现象表明CEWH可以激活毛囊从休止期重新进入生长期，并保持这种激活状态。CEWH的疏松大孔结构有利于长期细胞和血管浸润，有利于实现组织整合，这对于毛囊生长周期的持续调节至关重要。为了阐明毛囊再生的潜在机制，我们进一步分析了小鼠皮肤切片的转录谱。Wnt/β-catenin和Notch信号通路以及巨噬细胞募集和M2表型转换信号通路明显上调。由植入物CEWH引起的以M2巨噬细胞为主导的免疫微环境通过Wnt/β-catenin和Notch信号通路激活毛囊再生。
图5. CEWH的体内毛囊再生调节和相关信号通路。
鉴于CEWH支持细胞增殖和体内招募巨噬细胞的能力，我们研究了其对皮肤创伤修复的作用。我们使用了BALB/c小鼠的切除伤口愈合模型，并记录伤口闭合率随时间的变化。CEWH治疗组的愈合后皮肤表现平坦且几乎没有疤痕，甚至显示出新生毛囊迹象。在创伤后第6天，CEWH组伤口愈合率最高，达到74%，而商用水凝胶治疗组、蛋清直接加热的水凝胶治疗组和无处理对照组的伤口愈合率分别约为62%、47%和45%。愈合皮肤组织染色结果也表明了CEWH治疗组的更有序胶原纤维排列和新生毛囊存在。这表明CEWH可以加速胶原沉积，从而加速了伤口愈合。进一步地，为了研究CEWH是否调节免疫反应并在愈合过程中募集M2巨噬细胞，我们对愈合的伤口组织切片进行了IHC染色。与商用水凝胶组和对照组相比，用蛋清蛋白处理的实验组均表现出更强的CD206信号表达和较弱的CD86信号表达。这种现象表明CEWH贴敷可以诱发M2巨噬细胞的持续正向调节，从而进一步增强毛囊再生并加速伤口愈合，恢复皮肤功能。
图6. CEWH的体内伤口愈合治疗效果。
综上所述，本研究报告了一种生物相容性蛋清衍生水凝胶的开发和组织过程应用（促进毛囊再生和伤口愈合）。CEWH是由蛋清和CDs的混合稀释溶液加热得到。展开的蛋清蛋白链与CDs结合，形成低密度但稳定的三维网络结构，显示出优异的的拉伸特性也促进了水凝胶中封装的生物活性物质的释放。这种交联方式有效防止了蛋白链的广泛自交联。CEWH的蛋白质含量丰富，孔隙结构大，为细胞生长、聚集和血管渗透创造了理想的支架，并促进了与周围组织的整合。皮下植入后，CEWH可以招募巨噬细胞并通过IL-6/STAT3通路促进其以M2表型持续增殖，调节皮下微环境。这种持续的免疫微环境调节有效地刺激了毛囊的长期再生。我们进一步证明，CEWH 激活的免疫反应加速了小鼠伤口闭合并促进了皮肤功能的恢复。CEWH的独特性质、简便的制备方法以及丰富的蛋清活性成分，表明其作为人类毛囊再生和其他组织修复和再生应用的天然生物材料具有广阔的潜力。该研究为利用蛋清作为多功能生物材料在组织工程中的应用提供了一种思路，展示了其在再生医学中的广泛应用前景。
本工作由以下基金支持：
澳门特别行政区科技发展基金: (0139/2022/A3, 0128/2020/A3, 0131/2020/A3, 0007/2021/AKP, 006/2022/ALC, 0002/2021/AKP and 0120/2020/A3);
澳门大学基金：( MYRG2020-00164-IAPME、MYRG-CRG2022-00009-FHS及MYRG-GRG2023-00053-FHS-UMDF);
澳门大学讲座教授研究发展基金：(CPG2020-00026-IAPME);
深港澳科技计划项目(C类项目): (SGDX20210823103803021);
澳门大学博士后基金（0037/2021/APD）
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https://doi.org/10.1002/advs.202404702
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