H2S被认为是调节生理系统的第三种重要气体递质，体内H2S水平异常会对健康造成巨大威胁。虽然很多传统检测方法已经实现了对H2S的准确测定，但仍然受到仪器昂贵、需要训练有素的操作人员和耗时的限制，阻碍了实时和现场分析的应用。比色和荧光法在分析物的现场检测中具有显著优势，但针对H2S的光谱检测法经常受到诸如谷胱甘肽、半胱氨酸等生物硫醇的干扰。除此之外，针对H2S的检测还存在分析模式单一的不足。有鉴于此，齐鲁工业大学杨升宏团队以谷氨酸铜(Glu-Cu)和乙二胺盐酸盐(EDA·2HCl)为前驱体，采用固相热解法制备了正电性的铜掺杂碳点纳米酶(Cu-CDNEs)，将碳点优异的荧光特性和纳米酶的类过氧化物酶活性进行了有效的整合。基于H2S对Cu-CDNEs类过氧化物酶活性独特的抑制作用及H2S和3,3',5,5'-四甲基联苯胺对活性氧的竞争作用，建立了比色和荧光双模式H2S分析体系，具有较高特异性和灵敏度。此外，得益于表面正电性和类过氧化物酶活性，所设计的Cu-CDNEs对革兰氏阳性/阴性细菌表现出高效的抗菌活性。本研究可为环境和生物医学领域功能纳米酶材料的合理设计和广泛应用提供有价值的参考。相关成果以“Copper-doped carbon dots nanozymes for multi-signal specific hydrogen sulfide assay and broad-spectrum antibacterial” 为题，发表在期刊Chemical Engineering Journal上。论文第一作者为齐鲁工业大学化学与化工学院硕士研究生李子涵，通讯作者为齐鲁工业大学杨升宏副教授和胡伟教授，以及江西师范大学刘健助理研究员。 通过简单的微波辅助固相合成策略，即将Glu-Cu和EDA·2HCl的混合物热解5分钟，合成了具有良好荧光和类酶活性的Cu-CDNEs。合成的Cu-CDNEs可发出明亮的蓝色荧光，量子产率可达31.2% (图1A)。然而，单独热解Glu-Cu或EDA·2HCl得到的Cu-CDs和N-CDs的荧光性能几乎可以忽略不计(图1C)。Cu-CDNEs的良好荧光特性应归功于EDA·2HCl对Cu-CDs的表面钝化和氮掺杂作用。Cu-CDNEs还表现出良好的类过氧化物酶活性，如图1B所示，在Cu-CDNEs和H2O2存在下，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)可以被氧化为oxTMB，溶液颜色由无色变为蓝色。此外，除了Cu-CDs具有微弱的类过氧化物酶活性外，Cu-Glu和N-CDs均不能表现出明显的类过氧化物酶活性(图1D)。上述结果表明，Cu-CDNEs的优异的荧光性能和类过氧化物酶活性应归因于Cu-Glu和EDA·2HCl反应的协同效应。图1.Cu-CDNEs的激发和发射光谱(A)，Cu-CDNEs-TMB/H2O2/ TMB/H2O2的紫外可见吸收光谱(B)，Cu-CDs、N-CDs和Cu-CDNEs的发射光谱(C)，Glu-Cu/Cu-CDs/N-CDs/Cu-CDNEs-TMB- H2O2的紫外可见吸收光谱(D)。
TEM图像显示，Cu-CDNEs呈单分散结构，粒径分布在2-5 nm之间，平均粒径约为3.4 nm，晶格间距为0.21 nm，对应于石墨的(100)晶面(图2A和B)。HAADF-STEM图像表明Cu原子成功掺杂到Cu-CDNEs中(图2B)。图2C的XRD图谱显示，Cu-CDNEs在25°左右存在较宽的衍射峰，具有类似石墨的结构，说明Cu原子分散在碳点上。在FT-IR光谱中，ν(O-H)、ν(N-H)、ν(C-H)、ν(C=O)、ν(C-N)和ν(C-O)的特征吸收分别位于3551 cm-1、3471 cm-1、3409 cm-1、1639 cm-1、1615 cm-1和1506 cm-1，证实Cu-CDNEs具有丰富的氧官能团和氮官能团(图2D)。另外，在1021cm-1处出现了N-Cu-N峰，进一步证明了Cu-CDNEs中Cu原子的存在。高分辨率C1s光谱表明存在C=O/C=N (288.1 eV)、C-O/C-N (285.9 eV)和C-C/C=C (284.8 eV)(图2E)。N1s 观察到Graphitic-N (401.2 eV)、Pyrrolic-N (399.8 eV)、Cu-N (399.0 eV)和Pyridinic-N (399.3 eV)的存在(图2F)。在O1s高分辨率XPS光谱(图2G)中，可以观察到C=O ( 531.3 eV)和C-O (532.5 eV)两个典型峰。高分辨率Cu 2p光谱显示存在Cu (II)峰及Cu (I)峰(图2H)，这说明微波热解过程中部分Cu2+被还原成Cu+。其中，Cu-CDs和Cu-CDNEs中Cu-N的含量由23.5%提高到30.1%，除此之外，Cu-CDNEs中Cu(I)的含量(45.1%)远高于其在Cu-CDs(19.6%)和Glu-Cu(0%)中的含量。因此，Cu-CDNEs优异的催化活性应归因于Cu-N含量的增加和合适的Cu (I)/Cu (II)数量比。 ![]( "1.jpeg")
图2. Cu-CDNEs (A)的TEM图像，插图:Cu-CDNEs的尺寸分布。Cu-CDNEs、Cu-CDs、N-CDs的高分辨率TEM、HAADF-STEM图像(B)和XRD谱图(C)。Cu-CDNEs、Cu-CDs、N-CDs的FT-IR光谱(D)。Cu-CDNEs、Cu-CDs和N-CDs/Glu-Cu的C 1s (E)、N 1s (F)、O 1s (G)和Cu 2p (H)的高分辨率XPS光谱。
我们进一步验证了Cu-CDNEs的类过氧化物酶活性，如图3A所示，无色的OPD可以被Cu-CDNEs-H2O2体系产生的ROS氧化成黄色的2,3-二氨基吩嗪，在450 nm处显示明显的吸收。此外，我们还分别用叔丁醇(TBA)、色氨酸(Try)和对苯醌(PBQ)作为⋅OH、1O2和O2⋅-的清除剂，进一步证明了ROS的生成。从图3D可以看出，Cu-CDNEs在中性条件下的催化活性可以达到pH=4时的50%。以Cu-CDNEs为催化剂，TMB/H2O2为底物，进行了稳态动力学测量，计算了催化体系中的Michaelis常数(Km)和Vmax。对于TMB，催化体系中的Km和Vmax分别为0.076 mM和4.5×10-8 M·s-1(图3E和F)。此外，在图3G和H中，以H2O2为底物，Km和Vmax进一步计算为3.36 mM和0.85 × 10-9 M·s-1。本文提出的Cu-CDNEs具有高的底物亲和力和反应速率，表明Cu-CDNEs具有良好的类过氧化物酶活性，可以满足多种应用要求。图3. Cu-CDNEs、OPD-Cu-CDNEs、OPD-H2O2和OPD-Cu-CDNEs- H2O2的紫外可见吸收光谱(A)、TBA、PBQ和Try诱捕剂对Cu-CDNEs-H2O2的自由基清除实验(B)、DMPO-⋅OH和O2⋅-、TEMP-1O2对Cu-CDNEs-H2O2的EPR光谱(C)、不同pH下Cu-CDNEs的类过氧化物酶活性(D)、Cu-CDNEs催化H2O2氧化TMB的稳态动力学分析(E, F)、Cu-CDNEs催化H2O2分解的稳态动力学分析(G, H)。
在图4A中，Cu-CDNEs-H2O2体系产生的ROS可将TMB氧化为最大吸收波长在652nm的oxTMB。在S2-存在时，652 nm处的吸光度急剧下降，溶液颜色变为近乎无色。在我们的前期工作中，H2S可以更容易地与Cu2+/Cu+反应，形成稳定的CuS/Cu2S物种，并破坏铜配合物原有的活性位点。因此，H2S与Cu物种的不可逆结合可导致Cu-CDNEs催化活性的降低。此外，H2S还会与TMB竞争ROS，导致生成oxTMB量减少，从而引起吸光度的降低。随着S2-的加入，吸光度与S2-浓度在0.1-100 μM范围内呈现良好的线性关系 (图4B和C)，检出限可达20 nM。如图4D所示，TMB或H2O2的加入不会导致Cu-CDNEs水溶液荧光强度的明显变化，而TMB和H2O2同时存在时，Cu-CDNEs的荧光表现出明显的猝灭效应。有趣的是，S2-可以有效地抑制这一过程，并且随着S2-浓度的增加，荧光强度逐渐增加(图4E)，在0.1-100 μM范围内存在良好的线性关系，检出限为25 nM (图4F)。![]( "1.jpeg")
图4. 添加S2-前后Cu-CDNEs和Cu-CDNEs-TMB-H2O2的紫外可见吸收光谱(A)和荧光光谱(D)。加入不同浓度的S2-后Cu-CDNEs和Cu-CDNEs- TMB-H2O2的紫外可见吸收光谱(B)和荧光光谱(E)。A0-A (C)和I/I0 (F) 随S2-浓度的变化曲线。
从图5A和B中可以看出，所建立分析方法的特异性对缓冲液浓度和pH波动具有较高的耐受性。为了进一步检验该传感系统的抗干扰能力，在不同H2S浓度下进行了基于扫描比色分析模式的主成分分析(PCA)。如图5C-F，PCA分布表明，即使在0.5 μM、1.0 μM、3.0 μM和5.0 μM的较低浓度下，H2S也能实现与生物硫醇的有效区分。图5. 不同HAc-NaAc缓冲液浓度(A)和pH (B)对H2S和生物硫醇信号响应的影响检测系统对0.5 μM (C)、1 μM (D)、3 μM (E)、5 μM (F)的H2S和生物硫醇的二维PCA图。
得益于Cu-CDNEs丰富的表面正电荷和良好的类过氧化物酶活性，其被进一步探索应用于抗菌领域。如图6A1和B1所示，Cu-CDNEs对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出优异的抑菌能力。基于活性氧和静电作用的协同效应，Cu-CDNEs-H2O2表现出比单独Cu-CDNEs更好的抗菌能力(图6A1/B1/A4/B4)。如图6A5/B5所示，当Cu-CDNEs浓度达到50 μg·mL-1时，Cu-CDNEs-H2O2组对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率显著高于Cu-CDNEs组，当Cu-CDNEs浓度超过100 μg·mL-1时，细菌的生长几乎可以被绝对抑制。实验结果表明，设计的Cu-CDNEs在抗菌领域具有良好的应用潜力。图6. 不同处理下大肠杆菌(A1)和金黄色葡萄球菌(B1)菌落的琼脂平板数码照片。不同浓度Cu-CDNEs对大肠杆菌(A2)和金黄色葡萄球菌(B2)的抗菌作用。不同浓度Cu-CDNEs-H2O2对大肠杆菌(A3)和金黄色葡萄球菌(B3)的抗菌作用。不同处理下大肠杆菌(A4)和金黄色葡萄球菌(B4)的细菌活力测定。不同浓度Cu-CDNEs和Cu-CDNEs-H2O2对大肠杆菌(A5)和金黄色葡萄球菌(B5)的细菌活力测定。
总之，本工作通过微波辅助热解法合成了兼具优异光学性能和类过氧化物酶活性的Cu-CDNEs。基于H2S对Cu-CDNEs类过氧化物酶活性的抑制作用以及H2S和TMB对ROS的竞争效应，构建了H2S比色和荧光双模式检测体系。所建立的分析平台具有高灵敏度和高特异性，能有效抵御生物硫醇的干扰。此外，表面正电性和类过氧化物酶活性赋予了Cu-CDNEs优异的广谱抗菌能力，为生物医学应用提供了出色的候选物。本研究的主要优势体现在Cu-CDNEs的巧妙设计和简便合成，以及其在H2S检测和抗菌方面的应用，将进一步促进多功能纳米酶的朝阳发展。![]()
https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.155081
