过氧亚硝酸根（ONOO−）是一种短寿命的内源性生物活性氧（ROS），由超氧阴离子自由基（O2·−）和一氧化氮（·NO）的扩散控制反应形成。ONOO−的过度产生与肝损伤、炎症性疾病、神经退行性疾病和心血管疾病，甚至癌症密切相关。荧光分析法具有便捷、可实时成像等优点，正成为ONOO−传感的研究热点，但目前对于ONOO−的荧光传感模式分为增强型、猝灭型和比率型，没有新的检测模式。
鉴于此，广州大学牛利教授、荣铭聪副教授团队通过组合绿色荧光碳点（G-CDs）和橙色荧光碳点（O-CDs）构建了基于波长移动型ONOO−的荧光传感平台。无相互作用的G-CDs和O-CDs经简单混合形成M-CDs，可对浓度范围为0-250 μM的ONOO−实现精确的定性及定量分析，检测限为10 nM。在ONOO−浓度低至3 μM的范围内，表面态发光的G-CDs会与ONOO−发生氧化和硝化反应，使得大颗粒的G-CDs分裂为小颗粒G-CDs，其荧光发射波长从495逐渐蓝移至475 nm，并保持不变。在ONOO−浓度为3−250 μM的范围内，G-CDs的荧光强度保持恒定，而O-CDs的分子态荧光在ONOO−的氧化和硝化作用下逐渐猝灭，并引发O-CDs的逐渐聚集，高浓度范围构建了比率型荧光检测模式。此外，联合广州实验室刘倩研究员团队的细胞成像平台，M-CDs展现出对内源性和外源性ONOO−良好的细胞成像功能。这项研究不仅为ONOO−荧光传感提供了一种新的荧光波长移动检测模式，而且通过探索CDs与ROS反应后的形态和结构变化分析，为CDs的荧光机理提供了新的见解。
相关成果以“Splitting and Aggregation of Carbon Dots: Wavelength-Shifted and Ratiometric Fluorescence Sensing of Peroxynitrite”为题，发表在期刊 Analytical Chemistry 上。论文第一作者为广州大学化学与化工学院硕士研究生何政，通讯作者为广州大学牛利教授、荣铭聪副教授和广州实验室刘倩研究员。
通过简单的一锅水热合成策略，以派洛宁Y和藏红花素T为前驱体，分别制得了G-CDs和O-CDs。如图1a、b所示，O-CDs是平均粒径为2.1 nm的球状颗粒，G-CDs是平均长轴/短轴为9.6 nm/5.8 nm的椭圆形颗粒，这可以通过它们各自的TEM图像来验证（图3a、图3d）。G-CDs和O-CDs的特征晶格间距均为0.21 nm，对应于石墨碳的（100）面。通过傅里叶变换红外（FT-IR）光谱和X射线光电子能谱（XPS）研究了G-CDs和O-CDs的化学键合结构（图1c−i），大量的氨基和羟基基团保证了M-CDs优异的水溶性和稳定性。。M-CDs形貌、功能结构与G-CDs和O-CDs分开检测结果一致，证实了这两种CDs之间不存在强相互作用。
图1. (a) M-CDs的TEM图像，插图：O-CDs（上）和G-CDs（下）的HRTEM图像。(b) O-CDs（上）和G-CDs（下）的粒径分布。(c) O-CDs和G-CDs与ONOO−反应前后的FT-IR光谱。G-CDs与ONOO−反应前后的(d) C 1s，(e) N 1s,(f) O 1s光谱。O-CDs与ONOO−反应前后的(g) C1s， (h) N 1s, (i) O1s光谱。
如图2a所示，O-CDs在250和350 nm处的吸收峰分别归属于C=C的π−π*跃迁和C=O/C=N的n−π*跃迁。550 nm处的吸收峰归因于O-CDs表面上保留的前体藏红花素T的官能团。插图显示了G-CDs在410 nm处的吸收峰，其归于G-CDs的π-共轭体系n−π*跃迁。此外，M-CDs的实验吸收谱图与G-CDs和O-CDs的吸收谱图加和近似，表明在这两个CDs之间没有形成新复合物。如图2c，d所示，在ONOO−浓度为0-3 μM范围内，G-CDs的荧光发射峰位逐渐从495 nm蓝移至475 nm。发射波长与ONOO−浓度呈良好的线性定量关系（Δλ = 5.75[ONOO−] + 0.121），检测限为478 nM（3σ/s.）。此外，利用O-CDs与G-CDs的荧光强度比值，也可构建定量方程，检测限仅为10 nM（图S8）。这种波长移动型传感模式可以消除异质干扰，提高传感特异性，特别是在低浓度范围内，波长移动型传感模式和比率传感模式可以提供相互验证。在3-250 μM的高浓度范围内，O-CDs在570 nm处的荧光强度随着ONOO−含量的增加而逐渐降低；同时，G-CDs的荧光发射峰在475 nm处保持稳定，基于F570/F475与ONOO−的浓度，构建另一段定量曲线（F570/Fp = −0.00270[ONOO−] + 1.33），且溶液展现出明显的颜色变化，从橙色变为绿色（图2e，f）。特异性研究如图2g所示，除了HClO之外，各种干扰物即使在250 μM的高浓度下对ONOO−检测基本无影响。HClO可同时猝灭G-CDs和O-CDs的荧光，且G-CDs对ONOO−具有优先作用特征，可区分ONOO−和HClO（图S9）。因此，M-CDs传感体系对ONOO−检测具有良好的特异性和灵敏度，在实际应用中具有一定的潜力。
图2. (a) O-CDs、G-CDs和M-CDs的紫外-可见吸收光谱。插图：G-CDs的局部放大详图。(b) 不同体积比的G-CDs和O-CDs的荧光光谱（λex：410 nm）。(c) M-CDs对低浓度ONOO−（0-3 μM）的荧光响应光谱。(d) G-CDs的波长位移值与ONOO−浓度的定量曲线。(e) M-CDs对高浓度ONOO−（3-250 μM）的荧光响应光谱。插图：含/不含250 μM ONOO−的M-CDs荧光照片。(f) M-CDs的荧光强度比值（F575/F475）与ONOO−浓度的定量曲线。(g) M-CDs与各种干扰物（250 μM）对ONOO−的选择性荧光响应。
接着，通过形貌和结构表征进一步明确M-CDs与ONOO−的作用机制。如图3a-f所示，与ONOO−反应后，M-CDs的形态发生变化，G-CDs逐渐裂解变小，O-CDs逐渐聚集。混合状态下（M-CDs），分裂的G-CDs以小团簇的形式一簇簇分散，并且保持在与G-CDs的原始尺寸相似的范围内紧密接近（图3g）。CDs单独状态研究：在0-3 μM的ONOO−下，G-CDs的平均尺寸逐渐从9.6 nm/5.8 nm减小到1.4 nm。与1 μM ONOO−反应后，约48%的G-CDs被切割成2.4 nm的小颗粒，在3 μM ONOO−下，约100%的G-CDs被转化为1.4 nm的颗粒（图3b，c）。在250 μM ONOO−下，裂解G-CDs仍为1.4 nm颗粒，表明在3 μM ONOO−下，裂解G-CDs外部形成稳定的官能团（图S10）。同时，如FT-IR所示（图1c），与ONOO−反应后，1128和3436 cm−1处的吸收峰急剧下降，而840 cm−1处的吸收峰（硝基），1722 cm−1和1485 cm−1急剧增加，这表明G-CDs的许多C-N和C-O基团被氧化和硝化成-COOH基团，许多N-H基团被氧化成N-O基团或NOx气体（氮元素的含量急剧下降，图S2）。同样，参考高分辨率XPS谱结果（图1d-f），C-N和C-O键消失，N-H键的含量减少，产生新的O-C-O，N-O和C-O键。由于其他ROS不能使G-CDs的荧光波长蓝移，这种形态结构信息表明，ONOO−的荧光发射波长移动传感机制与G-CDs减小的颗粒尺寸或G-CDs的表面逐渐氧化和硝化有关。由于在后续研究中，我们发现G-CDs的绿色荧光固定在特定波长，与它们的粒径大小无关，因此G-CDs的荧光来来源于对应于O-C-O、N-O和C-O键的表面态发光。我们推测，椭圆形的G-CDs是由几个小CDs（约1.4 nm）通过化学键组装而成，并通过C-N和C-O键连接，ONOO−可以破坏这些共价键，并进一步将这些较大的G-CDs切割成球形小颗粒G-CDs。与之不同，O-CDs的荧光来源于其表面的分子态官能团。与ONOO−反应后，O-CDs表面稳定的官能团如C-N/C-O基团被氧化成C-O基团，许多N-H基团也被硝化成吡啶N或NOx气体（图1c，g-i和S2）。同时，ONOO−也导致荧光猝灭和O-CDs的聚集，O-CDs的平均尺寸从2.1 nm增加到4.8 nm，然后增加到7.2 nm，最后增加到9.3 nm（图3d-f和S10）。此外，在与ONOO−反应后，M-CDs的550 nm附近的吸收带（属于O-CDs）显著降低（图3i），表明在O-CDs上形成了新的复合物，荧光传感过程与静态荧光猝灭相关。对ONOO−、O-CDs、G-CDs和M-CDs的电势测量表明它们都带负电荷。与ONOO−反应后，由于O-CDs表面官能团的变化，O-CDs比之前带更多的正电荷；为了降低表面能，小O-CDs倾向于聚集成大O-CDs（图3 j）。相反，G-CDs比以前带更多的负电荷，表明G-CDs在水溶液中的稳定性变得更好，与它们的尺寸变化规律一致。O-CDs和G-CDs不同的表面电势变化也意味着ONOO−与其表面态的不同相互作用以及这两种CDs的不同荧光发射机制。由于O-CDs的浓度比G-CDs高得多，M-CDs的结果趋向与O-CDs的结果一致。此外，通过时间分辨荧光光谱对荧光传感的过程进行了研究。如图3k所示，O-CDs的荧光寿命在与ONOO−反应后保持稳定（从2.02到2.95 ns，在拟合波动范围内），证实了其静态荧光猝灭过程，而G-CDs的荧光寿命从6.74 ns降低到3.12 ns，表明传感过程中涉及明显的动态荧光过程（图3l）。这些结果也证实了G-CDs和O-CDs的不同发光机制以及它们对ONOO−的不同传感机制。根据G-CDs和O-CDs的荧光响应和形态结果（图2b、c和图3a-f），G-CDs和O-CDs的荧光机制分别为表面态发光和分子态发光。
图3. (a) 0、(b) 1 μM和(c) 3 μM ONOO−浓度下G-CDs的TEM图像。(d) 0、(e) 3 μM和(f) 50 μM ONOO−浓度下O-CDs的TEM图像。(g) 含250 μM ONOO−的M-CDs的TEM图像。(h) 图3g中聚集O-CDs和分裂G-CDs的粒度分布图。(i)250 μM ONOO−、M-CDs的紫外可见吸收光谱，以及250 μM ONOO−中M-CDs之和的理论和实验光谱。(j)与250 μM ONOO−反应前后O-CDs、G-CDs和M-CDs的ζ电位。(k) O-CDs和(l) G-CDs在与250 μM ONOO−反应前后分别在570和495 nm处的时间分辨荧光光谱。
最后，选用RAW264.7细胞系作为细胞模型，通过标准CCK-8试验评价M-CDs的细胞毒性。结果表明M-CDs具有良好的生物相容性。随后，应用M-CDs对外源性/内源性ONOO−进行细胞内成像。如图4所示，M-CDs对细胞内源性和外源性ONOO−均表现出良好的细胞成像。此外，G-CDs和O-CDs在细胞内的分布位置和密度是相同的，这表明M-CDs能很好得进入细胞各个部位，对内源性/外源性ONOO−的动态细胞内成像具有潜在的应用价值。
图4. RAW264.7细胞中M-CDs对外源性和内源性ONOO−的荧光显微镜图像。
综上所述，基于G-CDs的分裂和O-CDs的聚集，构建了一种新型的波长移动型及比率型ONOO−荧光传感检测方法。随着ONOO−的加入，G-CDs的桥接和表面活性-NH2/C-N/C-O基团通过动态荧光传感过程被氧化和硝化为-COOH，N-O基团和NOx气体，大颗粒的G-CDs从9.6/5.8 nm（长/短轴）分裂为2.4 nm，最后稳定为1.4 nm，伴随着G-CDs荧光发射波长的蓝移。同时，O-CDs的表面-NH2/C-N/C-O发光官能团被氧化或硝化成C-O基团和NOx气体，较小的O-CDs逐渐变成较大的聚集体，伴随着静态荧光猝灭过程。此外，能够使用M-CDs对内源性和外源性ONOO−的动态细胞内成像。本工作为探索ONOO−荧光传感的新手段和研究CDs与ROS反应的荧光机理提供了新的分析思路。
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https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c04015
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