细胞焦亡是一种调节性细胞死亡形式，其特点是细胞膜穿孔的形成、细胞肿胀和细胞裂解。在细胞焦亡过程中，GSDM家族蛋白在细胞膜上寡聚并形成孔道，释放炎性细胞因子和损伤相关分子模式DAMPs，引发强烈的炎症反应和抗肿瘤免疫反应。已有研究显示，约15%的肿瘤细胞发生焦亡即可有效清除肿瘤。然而，现有化疗药物诱导焦亡时存在非特异性激活的问题，因此设计高效特异性的焦亡诱导剂、实现高效肿瘤免疫治疗成为肿瘤诊疗研究领域的前沿和热点。
作为一种新兴的肿瘤治疗方法，光动力疗法（PDT）具有微创、副作用小、选择性治疗等优点。在PDT过程中，光敏剂（PSs）在光照下被激活产生活性氧（ROS），从而导致肿瘤细胞死亡。然而，PDT通常会触发肿瘤细胞凋亡，而凋亡被认为是免疫沉默的调节性细胞死亡，这限制了PDT在免疫治疗中的效果。尽管已经开发出一些基于纳米载体的PDT诱导的焦亡策略，但这些纳米系统的复杂成分可能会带来更高的潜在生物毒性。因此，亟需一种简单且安全的高效PDT诱导肿瘤细胞焦亡策略。
相比于传统光敏剂（PSs），碳点（CDs）光敏剂凭借其卓越的光学性能、高光稳定性、成本效益以及良好的生物相容性，在光动力疗法（PDT）中展现出了显著的潜力。2014年，我们课题组首次报道了红光发射的N,S共掺杂、带正电荷的CDs（简称PCDs）作为纳米光敏剂应用于PDT，展示了其在体外和体内实验中的优异性能（Nature communications, 2014,5,4596）。在随后的十年里，具有PDT固有特性的各种CDs受到了广泛关注。目前，已经开发出多种具有内在特性的CDs纳米光敏剂，例如酸响应型、过氧化氢响应型或谷胱甘肽响应型、亚细胞器靶向型以及余辉发光型，这些特性通过自产氧气、放大氧化应激、促进I型光化学反应以及实现余辉检测来增强癌症治疗中的PDT效果。然而， CDs纳米光敏剂在癌症PDT中的应用仍面临许多科学挑战。例如，设计新的策略并利用CDs光敏剂触发肿瘤细胞焦亡，以克服目前PDT在免疫治疗中的不足仍然面临挑战。
基于此，中科院理化所葛介超研究员课题组提出了一种简单的时空编程策略，通过该策略使 CDs光敏剂能够调节细胞焦亡，从而增强肿瘤的光动力免疫治疗。通过将PCDs（Nat. commun., 2014, 5, 4596）与癌细胞的孵育时间从常规途径的6小时缩短到先进途径的0.5小时，可以有效观察到溶酶体和膜靶向的PCDs。体外研究表明，在光照下，溶酶体靶向的PDT主要诱导肿瘤细胞凋亡，而膜靶向的PDT表现出诱导GSDME介导的肿瘤细胞焦亡的强大能力，从而提高了PDT的疗效并强烈激活了免疫反应。最后，体内实验显示，膜靶向的PDT对肿瘤消除的作用更为显著。同时，它诱导了DAMPs和炎性细胞因子的释放，促进了树突状细胞（DCs）的成熟，并激活了T淋巴细胞，从而引发强烈的适应性免疫反应，最终抑制了肿瘤转移和远端肿瘤的生长。该研究表明，PCDs光敏剂可作为细胞焦亡的纳米调节器，从而显著扩展了CDs光敏剂在免疫治疗中的生物医学应用。
相关成果以“An Aged Tree with a New Bloom: A Simple Spatiotemporal Programming Strategy Enables Carbon Dot Photosensitizers to Regulate Cell Pyroptosis for Enhanced Tumor Photodynamic-immunotherapy”为题发表在《Nano Letters》上。通讯作者为中科院理化所葛介超研究员，中科院理化所肖海华研究员和山东师范大学唐波教授，第一作者为中科院理化所博士生陈铁金。
通常情况下，为了使纳米颗粒有效地积聚在细胞内，需要3到24小时的孵育时间。在此研究中，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）研究了肿瘤细胞对PCDs的摄取情况，并展示了孵育条件（图1A）。最初，采用6小时的孵育时间（常规途径）来研究肿瘤细胞对PCDs的摄取情况，发现PCDs能够渗透进入细胞内（图1B，上部）。近期研究表明，膜靶向的纳米药物、纳米酶或纳米光敏剂可以触发肿瘤细胞的焦亡，从而实现抗肿瘤免疫治疗。因此，我们探索了将孵育时间减少至0.5小时（先进途径）来确定肿瘤细胞对PCDs的摄取情况。正如预期的那样，CLSM图像显示PCDs主要定位在肿瘤细胞的外围（图1B，下部）。
为了确认不同孵育时间下PCDs在特定亚细胞器中的定位情况，分别使用商用荧光染料Lyso-Tracker和DiO作为溶酶体和细胞膜的特异性探针。如图1C所示，在6小时孵育时，由于PCDs与Lyso-Tracker之间的高Pearson相关系数（PCC为0.87）和重叠系数（OLC为0.88），观察到PCDs的红色荧光主要定位于溶酶体，而在0.5小时孵育时，PCDs的红色荧光与DiO很好地重叠（PCC为0.82，OLC为0.84），表明PCDs主要积累在细胞膜上，这归因于PCDs与细胞膜之间的静电相互作用。这些结果表明，通过简单调节孵育时间，可以成功实现膜靶向的PCDs。
图1. 肿瘤细胞中PCDs的荧光成像。
为了探究肿瘤细胞死亡的类型，首先检查了不同处理条件下细胞形态的变化。如图2A所示，在光照条件下，膜靶向光动力（记作PCDs-Mem+Light）和溶酶体靶向光动力（记作PCDs-Lyso+Light）组的细胞形态发生了显著变化，表明肿瘤细胞发生了死亡，而对照组（Control）、光照组（Light）和PCDs组的细胞形态保持不变。值得注意的是，在PCDs-Mem+Light组中，观察到了明显的细胞肿胀和来自质膜的巨大气泡（红色箭头），这是典型的细胞焦亡特征。而在PCDs-Lyso+Light组中，大多数死亡细胞表现出凋亡特征，表现为细胞缩小和凋亡小体的产生。基于此，可以推断膜靶向光动力可以引起细胞焦亡，而溶酶体靶向光动力诱导细胞凋亡。一般来说，在焦亡过程中，细胞膜受损，导致乳酸脱氢酶（LDH）等细胞内容物的释放。因此，检测了LDH的释放情况（图2B），结果显示，在PCDs-Mem+Light组中，LDH的释放量约为PCDs-Lyso+Light组的2.5倍，进一步证实了细胞焦亡的发生。
众所周知，GSDM家族蛋白是焦亡的特征性标志物。WB结果（图2C、2D）显示，PCDs-Mem+Light组中Caspase-3和GSDME的表达下调，而裂解型Caspase-3（上调3.0倍）和N端GSDME（上调1.4倍）上调，证实了Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡的发生。随后，采用Annexin V/PI染色法提供了更多关于焦亡和凋亡的证据。如图2E所示，PCDs-Mem+Light组显示Annexin V-FITC/PI双阳性，表明细胞膜被破坏并发生了细胞焦亡。相比之下，PCDs-Lyso+Light组主要显示Annexin V-FITC单阳性，细胞膜完整，主要代表细胞凋亡。最后，使用流式细胞术进行定量分析（图2F），结果显示，PCDs-Mem+Light组中焦亡细胞的比例约为54%，凋亡细胞的比例约为7%。而在PCDs-Lyso+Light组中，检测到37%的凋亡细胞和16%的焦亡细胞。这些结果也表明，PCDs-Mem+Light组具有更高的细胞毒性。因此，进一步使用MTT实验评估不同光照照射下的细胞杀伤效果。如图2G所示，与溶酶体靶向光动力相比，膜靶向光动力在0到10分钟的光照条件下均具有更强的肿瘤细胞杀伤能力。这些结果表明，膜靶向光动力疗法可以诱导强烈的细胞焦亡，从而增强肿瘤细胞的杀伤效果。
图2. PCDs诱导的光动力治疗诱导体外细胞焦亡和凋亡。
作为一种程序性细胞死亡形式，焦亡能够有效释放DAMPs，包括HMGB1的释放、钙网蛋白（CRT）向细胞膜的迁移以及ATP的分泌。因此，首先使用免疫荧光方法检测了肿瘤细胞中释放的HMGB1。如图3A和3C所示，在Control、Light、PCDs组和PCDs-Lyso+Light组中，可以观察到细胞核内的强绿色荧光与蓝色荧光重叠，而在PCDs-Mem+Light组中则未观察到绿色荧光，这表明HMGB1从细胞核中释放出来，从而促进树突状细胞（DCs）的成熟。随后，还检测了膜上的CRT。如图3B和3D所示，仅在PCDs-Mem+Light组中，可以看到细胞膜上存在强烈的绿色荧光信号，表明CRT成功迁移到细胞膜，作为一种免疫原性的“吃我”信号来激活机体的免疫反应。此外，使用ATP检测试剂盒检测了不同处理条件下肿瘤细胞释放的ATP。如图3E所示，在PCDs-Mem+Light组中，ATP的释放量约为对照组的3.5倍。这些结果证实，由膜靶向光动力诱导的肿瘤细胞焦亡能够有效释放DAMPs，从而改善肿瘤免疫抑制微环境并激活免疫反应。
图3. 细胞焦亡的免疫原性检测。
为了研究PCDs在体内光动力免疫治疗中的潜力，在BALB/c小鼠中建立了双侧4T1荷瘤模型，并每隔一天监测原发肿瘤和远端肿瘤的生长情况（图4A）。如图4B所示，在Control、Light和PCDs组中，原发肿瘤在治疗后20天内肿瘤体积增加了约16倍。同时，在PCDs-Lyso+Light组中观察到了约60%的肿瘤抑制率。然而，在PCDs-Mem+Light组中几乎实现了100%的肿瘤消除。与Control、Light和PCDs组相比，肿瘤切片的HE染色（图4D）进一步揭示了在PCDs-Mem+Light组和PCDs-Lyso+Light组中均出现了核固缩和细胞缩小的现象。此外，在PCDs-Mem+Light组中，核固缩和细胞缩小现象更为明显。
进一步研究了PCDs诱导的PDT对远端肿瘤的抑制作用。如图4C所示，在Control、Light、PCDs组和PCDs-Lyso+Light组中，即使在治疗后20天，肿瘤体积仍在增加，甚至达到约250 mm³；而在PCDs-Mem+Light组中，肿瘤抑制率达到了约90%，表明其显著抑制远端肿瘤的能力。最后，通过尾静脉注射肿瘤细胞建立了肺转移模型。在治疗后25天，从小鼠中收集了肺组织，并进行了HE染色（图4E），结果显示在PCDs-Mem+Light组中未发现转移性肺结节，而在其他组中均能检测到明显的结节，说明发生了肺转移。所有结果均证实，由PCDs诱导的膜靶向PDT能够诱导肿瘤细胞发生焦亡，从而有效地清除原发肿瘤，同时抑制远端肿瘤的生长和转移。
图4. PCDs诱导的光动力疗法在体内的应用。
为了确认PCDs能否有效诱导体内细胞焦亡，检测了相关的生物标志物。如图5A所示，免疫荧光实验表明，与Control、Light和PCDs组相比，PCDs-Lyso+Light组中裂解的caspase-3和N-GSDME的表达上调，并且在PCDs-Mem+Light组中进一步增强，证明了Caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡在体内的发生。此外，免疫荧光实验还显示，PCDs-Mem+Light组中CRT的表达最高（图5B）。使用Elisa试剂盒检测了血清中的HMGB1、IL-1β、IL-18和TNF-α水平。如图5C所示，与其它组相比，PCDs-Mem+Light组中HMGB1和炎性细胞因子的水平最高。CRT的过表达和HMGB1及炎性细胞因子的释放能够有效促进树突状细胞（DCs）成熟和T细胞活化。因此，采用流式细胞术检测DCs。如图5D所示，接受PCDs-Mem+Light处理的小鼠脾脏中成熟DCs的比例为30.2%，显著高于其他组。细胞毒性T淋巴细胞（CD8+ T细胞）和辅助T细胞（CD4+ T细胞）对于通过直接对抗肿瘤来调节适应性免疫至关重要。因此，随后评估了小鼠脾脏中CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的比例。如图5E所示，在PCDs-Mem+Light组中，CD8+ T细胞的比例约为15.2%，而CD4+ T细胞的比例约为30.4%，显著高于其他组。最后，通过免疫组化分析了肿瘤组织中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的浸润情况。与其它组相比，PCDs-Mem+Light组中CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的浸润更为明显（图5E）。总体而言，这些结果共同证实了PCDs诱导的膜靶向光动力疗法（PDT）能够有效诱导肿瘤细胞焦亡，从而促进DAMPs和炎性细胞因子的释放、DCs的成熟以及T细胞的激活，进而触发体内适应性免疫反应。
图5. 通过焦亡激活的体内抗肿瘤免疫反应。
综上所述，通过一种简单的时空调控策略，首次开发了一种新的肿瘤细胞焦亡诱导剂——PCDs纳米光敏剂。通过改变孵育时间从6小时到0.5小时，在光照条件下，分别实现了溶酶体靶向和膜靶向的光动力治疗，从而分别诱导肿瘤细胞凋亡和焦亡。体内外实验均表明，由膜靶向PDT诱导的肿瘤细胞焦亡可显著增强肿瘤细胞的免疫原性，并最终激活适应性免疫反应，从而根除原发肿瘤并抑制远端肿瘤的生长和转移。本研究开发了一种基于CDs的细胞焦亡时空纳米调节器，用于增强光动力免疫治疗，克服了当前PDT的局限性，同时拓宽了CDs纳米光敏剂在生物医学领域的应用。此外，这种简单的时空调控策略为旧的光敏剂提供了新的应用范例，并可能有助于基于传统光敏剂开发新型肿瘤细胞焦亡诱导剂，用于光动力免疫治疗。
本工作由以下基金支持：
National Natural Science Foundation of China (Grant No. 52272052), National Key Research and Development Program of China (No. 2022YFA1207600).
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https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c03913
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