澳大曲松楠/南科大李凯 Angew: 供体-受体型超碳点用于增强肿瘤光动力治疗

促进光敏剂内的电荷分离以及光敏剂和氧气之间的电子转移过程是提高O₂^•-产率的可行方法。利用电子供体和电子受体之间对电子的推拉效应，向光敏剂中引入电子供体或电子受体能够有效促进电荷分离。研究表明，构建供体-受体结构能够有效提高小分子光敏剂产生O₂^•-的能力。然而，大多数小分子光敏剂水溶性较差，往往需要借助二甲基亚砜或者通过进一步修饰来增加其水溶性。

碳点（CDs）是一类水溶性好的零维碳基纳米材料，具有生物相容性高、光稳定性好、原料简单易得、生产成本低等显著优势。迄今为止，CDs在生物传感、生物成像、疾病诊断、药物传递、抗炎治疗和抗菌应用等各个领域得到了广泛的研究。CDs优异的光物理化学性质使其能够吸收特定波长的光来产生ROS，进而用于肿瘤的PDT。由于CDs表面含有丰富的羟基、羧基、氨基等官能团，其能够通过共价键或非共价键聚集形成超碳点，进而改善其光物理化学性质。具有丰富sp²结构域的CDs内核中含有大量的电子，因此，通过引入含有吸电子基团的分子可以构建供体-受体型超碳点，从而促进O₂^•-的产生。

本课题组之前的研究发现，白光照射的单个CDs可以通过光催化作用产生•OH来杀伤肿瘤（Adv. Mater. 2023, 35, 2302705）。然而，能够特异性产生O₂^•-的CDs还尚未见报道。此外，CDs聚集后所形成的超碳点产生ROS的能力仍有待研究。基于以上背景，本工作以富电子的碳点作为电子供体、含吸电子基团的2,3-二氰基对苯二酚（DCHQ）作为电子受体，通过二次溶剂热的方法制备了供体-受体型超碳点（supra-CDs）。所制备的supra-CDs包含了作为电子供体的碳点组成的核心和作为电子受体的DCHQ组成的界面。电子受体的引入促进了supra-CDs内部的电荷分离和电子转移，在光照条件下，电子能够从富电子的核心转移到界面，并进一步和周围的游离氧气反应产生超氧自由基；同时，光诱导产生的空穴相关自由基被稳定在supra-CDs的核心，氧化重要的生物底物，协同增强光动力抗肿瘤治疗效果。此外，supra-CDs具有纳米尺度的粒径 (约20 nm)，使其能够通过肿瘤组织特有的EPR效应富集在肿瘤组织中，从而在小鼠皮下肿瘤模型中实现令人满意的PDT治疗效果。

相关成果以“Donor-Acceptor Type Supra-Carbon-Dots with Long Lifetime Photogenerated Radicals Boosting Tumor Photodynamic Therapy”为题发表在Angewandte Chemie上。文章通讯作者为澳门大学曲松楠教授和南方科技大学李凯副教授，第一作者为澳门大学和南方科技大学联合培养博士生张献明。

根据我们先前的工作，首先利用柠檬酸和尿素在溶剂热条件下制备了红光发射CDs，再将其和含吸电子基团的小分子DCHQ混合，通过二次溶剂热反应制备供体-受体型超碳点（supra-CDs）。图1b中的透射电镜结果展示了CDs的晶格条纹，间隔为0.21 nm。图1c和1d的透射电镜结果表明supra-CDs主要是由数个CDs组成。DLS分析显示，CDs的粒径约为2.5 nm，而supra-CDs的粒径为20 nm。随后，通过FTIR和XPS分析了CDs和supra-CDs的组成结构。图1f的FTIR结果表明CDs的表面官能团主要有-NH₂、-OH和C=O，而supra-CDs除了含有CDs的特征官能团，还含有DCHQ特征的-CN，证明了DCHQ的成功引入。图1g-1j的XPS结果表明，和CDs相比，supra-CDs中的酯基含量从14.42%增加到了26.48%，表明supra-CDs是由CDs表面的-COOH和DCHQ上的-OH之间通过酯化反应形成的。

图1. supra-CDs的合成和表征。

随后，我们探究了CDs和supra-CDs的光学性质。图2a中的紫外-可见吸收光谱结果显示，CDs在552 nm和416 nm处有两个特征吸收峰，可分别归因于碳点的表面相关态和核态。DCHQ的特征吸收峰位于346 nm处。由于DCHQ和CDs表面官能团发生反应，在supra-CDs的紫外-可见吸收光谱中，与CDs的表面相关的552 nm处的吸收显著降低，新出现一个与DCHQ相关的处于350 nm到450 nm的强的吸收带。作为对照，将CDs和DCHQ进行简单的物理混合对它们各自的紫外-可见吸收光谱没有明显影响。这些结果证明了supra-CDs的成功合成，并且supra-CDs不是CDs和DCHQ的简单物理混合。图2b和2c的结果显示，和CDs相比，supra-CDs具有更弱的红色荧光发射和更长的荧光寿命，证明supra-CDs中的高效电荷分离和更难的电子-空穴复合。为了进一步揭示supra-CDs的电荷分离过程，测试了supra-CDs的瞬态吸收光谱。图2d-f显示，CDs具有两个基态光漂白信号CAS1和CAS2，CDs在被激发后的大约2.1 ns时恢复到基态。对于supra-CDs（图2g-i），CDs相关的基态光漂白信号保持不变，在400 nm到440 nm处出现了一个新的基态光漂白信号，这可归因于电子由核心向界面激发态的转移的电荷分离态。对动力学的全局跟踪分析结果表明，电荷分离态具有4.6 × 10^-9 s^-1的电荷分离速率和27.1 ns的寿命（图2h、2i）。这些结果证实了supra-CDs的吸电子组分促进了光诱导电子从supra-CDs的核心转移到界面，而长时间的电荷分离过程更有利于光生电子和周围的氧气发生反应。

为了探究supra-CDs的光动力性质，利用不同的ROS探针和EPR光谱检测了其产生的ROS。利用DCFH作为总ROS探针，结果显示，supra-CDs在白光光照条件下能够产生比CDs更多的ROS（图3a），证明了其优异的光动力性质。随后，对supra-CDs产生的ROS的具体类型进行分析，研究结果表明，CDs在白光光照下能够产生一定量的¹O₂和O₂^•-，而supra-CDs在白光光照下几乎不产生¹O₂、只产生O₂^•-（图2b、2c）。进一步利用DMPO作为O₂^•-的捕获剂，通过EPR光谱确定了supra-CDs高效产生O₂^•-的能力（图2d-f）。有趣的是，在supra-CDs的EPR光谱中，除了O₂^•-所具有的1：1：1：1的特征信号外，我们还检测到一个额外的信号，这一信号可能来源于supra-CDs自身在光照条件下产生的空穴相关的自由基。为了验证这一猜想，在不加入捕获剂DMPO的条件下，检测了光照后的supra-CDs的EPR光谱，图2g-i中的结果证实了空穴相关自由基的产生，并且在停止光照40 min后，该信号强度的衰减只有不到20%，表明光生自由基可以长期稳定存在。

研究表明，光生空穴自身具有一定的氧化能力，因此，我们进一步探究了supra-CDs产生的空穴相关自由基能否氧化重要的生物底物。以BH₄和NADH为例，图4a的结果显示，白光照射后，BH₄在300 nm处的特征吸收峰明显降低，而其氧化产物BH₂在280 nm处的特征吸收峰明显提高，证明了BH₄的氧化；类似地，图4b中的结果显示，白光照射后，NADH在340 nm处的特征吸收峰明显降低，而其氧化产物NAH⁺在260 nm处的特征吸收峰明显提高，证明了NADH的氧化。

基于上述研究结果，我们提出了supra-CDs中光物理过程的可能机制（图4c）。supra-CDs的组成包括作为电子供体的富电子CDs核心和作为电子受体的吸电子界面。在白光照射下，供体和受体间的推拉电子效应促进了supra-CDs中的高效电荷分离。这个过程包括光激发电子从supra-CDs的核心转移到界面，并进一步与周围的氧气反应生成O₂^•-。同时，光诱导产生的空穴相关自由基被稳定在supra-CDs的核心，表现出明显的氧化能力，能够氧化重要的生物底物，如BH₄和NADH。这些独特的光物理过程证明了supra-CDs具有光诱导杀伤肿瘤细胞的潜力。

明确了supra-CDs的优异性质之后，我们进一步探究了其在抗肿瘤治疗中的生物应用。以小鼠乳腺癌细胞4T1作为肿瘤模型，首先探究了supra-CDs能否被肿瘤细胞摄取，结果表明，supra-CDs能够以时间依赖性和浓度依赖性的方式被4T1细胞摄取，并且supra-CDs能够分布在细胞质和细胞核中（图5c）。随后，通过CCK-8实验探究了supra-CDs的光毒性和暗毒性，实验结果表明，即使浓度为500 μg/mL的supra-CDs在黑暗条件下对肿瘤细胞活性的影响也很小，而用白光照射10 min后，肿瘤细胞的细胞活性仅仅只剩不到10%，证明了supra-CDs优异的PDT杀伤效果（图5a、5b）。利用DCFH和DHR123作为ROS探针对supra-CDs在细胞内产生ROS的能力进行探究，结果显示，和supra-CDs共孵育的4T1细胞在光照后发出明亮的绿色荧光，证明了supra-CDs在4T1细胞内产生O₂^•-的能力。这些结果证明，supra-CDs能够被肿瘤细胞高效摄取，并在白光照射后产生O₂^•-，进而杀伤肿瘤细胞。

基于supra-CDs在细胞层面的优异细胞杀伤能力，我们进一步评估了supra-CDs的体内抗肿瘤治疗效果。首先，利用小鼠皮下肿瘤模型探究了supra-CDs对肿瘤的靶向能力。尾静脉注射supra-CDs不同时间后解剖小鼠肿瘤和主要脏器，通过小动物活体成像仪检测supra-CDs的荧光来判断其在肿瘤和脏器中的分布，图6b中的结果表明，supra-CDs能够特异性富集到肿瘤并且在尾静脉注射12 h后富集最多。因此，我们选择在尾静脉注射12 h后对小鼠肿瘤进行白光照射。图6c-e中的结果表明，CDs在白光照射条件下能够在一定程度上抑制肿瘤生长，而supra-CDs则显示出更强的抗肿瘤治疗效果，能够完全抑制肿瘤生长甚至杀伤肿瘤。激活机体免疫不仅能够高效杀伤肿瘤，还能够预防肿瘤的复发和转移。研究表明，PDT具有激活机体免疫的潜力。因此，进一步探究了supra-CDs能否激活小鼠的免疫响应。图6f和6g结果表明，经supra-CDs的PDT治疗后，小鼠体内的CD8⁺的细胞毒性T淋巴细胞和记忆T细胞的比例明显提高，证明supra-CD能够有效激活小鼠体内的免疫反应。

综上所述，本工作通过二次溶剂热处理将红光发射CDs与电子受体DCHQ融合，成功开发了新型超碳点（supra-CDs），并证明了其具有高效的光诱导电荷分离性质，能够通过PDT有效杀伤肿瘤。在supra-CDs中，具有大量sp²结构域的富电子CDs构成核心态，具有吸电子基团的熔融DCHQ构成界面态，形成供体-受体型纳米结构。在白光照射下，特殊的供体-受体结构促进了激发电子从核心到界面的转移，从而产生了有效的光诱导电荷分离。随后，受激发的电子被传递到周围的氧气，进而生成O₂^•-。同时，光诱导产生的空穴相关自由基被稳定在supra-CDs的核心，可以进一步氧化细胞内重要的生物底物，如BH₄和NADH。得益于其优异的性能，supra-CDs的光致细胞杀伤能力得到了提高。此外，supra-CDs的粒径增大，达到约20 nm，可以通过EPR效应特异性富集到肿瘤组织，从而在小鼠皮下肿瘤模型中取得了令人满意的抗肿瘤PDT效果。本工作开发的构建supra-CDs的策略可以为CDs衍生的功能纳米材料的设计提供新的借鉴，丰富碳基纳米材料在生物医学领域中的应用。

本工作受到以下基金资助：

国家自然科学基金委（U21A2097，61935017，62175268，62288102）；

澳门特别行政区科技发展基金（0139/2022/A3，0007/2021/AKP，006/2022/ALC）；

广东省创新创业研究团队计划（2019ZT08Y191，2019QN01Y640，2022B1212010003）。

*本文为课题组供稿，首发于碳点人公众号，转载请后台联系开通白名单。