沈药大张景海/王思玲AFM：碳点基级联催化纳米反应器用于自增强靶向协同抗肿瘤

关成果以“Depolymerizable Enzymatic Cascade Nanoreactor for Self-Enhancing Targeting Synergistic Tumor Therapy”为题发表在Advanced Functional Materials上。沈阳药科大学张景海教授和王思玲教授为该文的共同通讯作者，沈阳药科大学博士生宋露明和赵勤富教授为共同第一作者。

首先，通过溶剂热法以柠檬酸、尿素为碳源，EDTA-Fe为铁源制备出具有多种纳米酶活性的红光碳点（Fe(III)-CDs）。在TEM图像（图1A）中，Fe(III)-CDs呈球形分布，平均粒径为3.16 nm。在HRTEM下观察到Fe(III)-CDs的晶格条纹，其晶格间距与石墨sp2杂化碳的晶格间距一致，表明Fe(III)-CDs具有类石墨结构。随后，将Fe(III)-CDs和GOx复合形成酶级联反应器FG。FG的TEM图像如图1B所示，FG分布均匀，粒径为29.9 nm，并且可以观察到FG中有明显的Fe(III)-CDs结构。利用L-Arg改变FG的表面电位，得到FGA 纳米粒。最后，在FGA表面包覆Fu，得到FGA@Fu。TEM图像（图1C）显示，FGA@Fu呈球形，分布均匀，粒径为95.2 nm。FGA@Fu中GOx的比例为53.1%。体系Zeta电位的变化如图1E所示，L-Arg的加入导致FGA表现出正电性，这为Fu的高效包覆提供了前提。XPS光谱（图1F）显示，FGA@Fu的O含量（24.25%）高于FG（19.68%），这可能与Fu中硫酸酯基团的O含量较高有关。红外光谱、紫外-可见光谱（图1G、H）均显示出纳米体系的成功制备。通过圆二色光谱（图1I）研究蛋白质空间结构的变化。与游离GOx相比，FG的二级结构有轻微的变化，这可能归因于GOx与Fe(III)-CDs之间氢键的形成。图1L显示了纳米粒的荧光发射光谱和荧光照片。Fe(III)-CDs和FG的发射峰均为638 nm，FGA和FGA@Fu的发射峰均为620 nm并且红色荧光强度明显增加。与蓝色荧光相比，红色荧光的波长较长，可以有效地避免了生物组织背景荧光的干扰，从而实现更好的荧光示踪。

紫外-可见光谱结果（图1H）显示，纳米粒在NIR区域具有良好的吸收，这意味着它们可能具有良好的光热转换能力。随后，计算出FGA@Fu的光热转换效率为19.6%。Fu和FGA之间通过静电作用力进行包覆，因此，弱酸及高温会促进体系的解聚。在TEM图像中（图2C），可以看到未处理的FGA@Fu呈均匀的球形。单独进行NIR照射后，纳米粒的尺寸略有减小。同时，FGA@Fu在pH 6.5溶液中分别显示出较大和较小的纳米粒。这一现象可能是由于FGA@Fu在酸性溶液中的静电力减少，系统趋于松散，导致更大的颗粒尺寸并释放出更小的纳米粒。在pH 6.5+NIR共处理下，FGA@Fu的粒径发生了显著变化，集中分布在30 nm，表明体系发生了明显的解聚。

FGA@Fu由天然酶GOx和具有多种纳米酶活性的Fe(III)-CDs构建，因此关于酶活性的研究非常重要。首先，通过pH和溶解氧的变化（图2E、S14）研究了GOx的活性。我们发现Fe(III)-CDs在形成FG配合物后不会干扰GOx的催化活性。此外，NIR照射可以促进体系解聚暴露活性位点并恢复原有活性。接着考察了体系的POD-like活性（图2F），FG组的变化趋势与Fe(III)-CDs组一致，FG+50°C组的反应速率显著高于FG组。与FG组相比，FGA@Fu的活性明显降低。而NIR照射后活性显著增加，这可能与系统解聚有关。使用总SOD活性检测试剂盒测定纳米粒的SOD-like活性（图2G）。FG的SOD-like活性与Fe(III)-CDs几乎相同，说明FG复合物形成后其活性位点不会被覆盖。经过计算，Fe（III）- CDs的SOD-like活性为1537.1 U mg⁻¹。使用DTNB来考察体系的GSH消耗能力(GSH-OXD-like)。如图2H所示，FG的GSH消耗能力与Fe(III)-CDs基本相同。在NIR照射后，FGA@Fu的GSH消耗能力显著提高，这可能与体系的解聚有关。

GOx可以消耗葡萄糖并产生过氧化氢，而Fe(III)-CDs的POD-like活性可以催化过氧化氢产生强氧化性·OH。为了验证Fe(III)-CDs是否可以与GOx级联催化产生·OH，我们使用了不同pH条件下的葡萄糖溶液进行考察。如图2I、J所示，单独Fe(III)-CDs和GOx不能使TMB变蓝，而FG复合物可以产生蓝色的TMBox。同时，pH 6.5时的反应速率明显强于pH 7.4。ESR结果也验证了·OH的产生。

肿瘤细胞对纳米粒的高效摄取是肿瘤治疗的关键。用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记GOx并通过CLSM观察细胞摄取（图3A）。在Fe(III)-CDs组中，Fe(III)-CDs组在被细胞摄取后呈不规则的点状分布。在GOx组中，GOx-FITC的绿色荧光大部分与细胞膜重叠，很难被细胞摄取，只有一小部分绿色荧光分布在细胞内。对于Fe(III)-CDs+GOx组（物理混合物组），红色和绿色荧光的分布与Fe(III)-CDs和GOx组相同。不同的是，在FG组中，红色荧光和绿色荧光几乎均匀的分布在细胞内部。与GOx组相比，FG组的绿色荧光强度明显增加。同时，共定位分析表明，FG组的GOx-FITC甚至可以分布在细胞核内部，这说明FG 纳米粒的形成对细胞摄取行为的变化密切相关。在NIR照射后，细胞对FGA@Fu的摄取明显增加，这可能与光热促进了系统的解聚有关。在Fe(III)-CDs组中，Fe(III)-CDs的红色荧光呈不规则的点状分布，但在FG组中分布相对均匀。基于以上现象，我们推测单独Fe(III)-CDs可能在溶酶体中富集，而FG组则可以产生更多的ROS通过破坏溶酶体进而实现逃逸。最后，对该猜想进行了验证（图3B）。

由于肿瘤微环境的特殊性，在肿瘤血管系统中存在过表达P-选择素的活化血管内皮细胞。同时，静息血管内皮细胞可以在ROS的刺激下被活化。Fu作为一种天然的多糖，是P-选择素的有效配体。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和活化的HUVECs（aHUVECs）被用于模拟肿瘤血管系统中的静息/活化的血管内皮细胞。首先，我们通过CLSM考察（图4A）了体系活化血管内皮细胞的能力。结果显示，纳米体系可以有效活化HUVECs并表达P-选择素。接下来，我们研究了FGA@Fu靶向aHUVECs的能力，结果如图4C和图S26所示。实验在4°C条件下进行，排除活细胞摄取的影响进而研究细胞表面与纳米粒的结合。结果显示FGA@Fu可以有效与aHUVECs结合，证明了体系对活化的血管内皮细胞的靶向性良好。

以上结果表明，该系统可以有效地活化HUVECs，Fu的包覆可以实现对aHUVECs的靶向。那么，FGA@Fu能否实现连续的“活化-靶向”进而实现自增强靶向呢？相关实验结果如图4D、S27A所示。FGA@Fu可以有效活化内皮细胞并增强后续制剂对活化内皮细胞的靶向，由此实现“自增强靶向”。据报道，活化的血管内皮细胞可以将岩藻多糖包覆的纳米粒运输到血管外侧，进而突破血管屏障。为了进一步考察FGA@Fu跨越内皮细胞的能力，我们又进行了Transwell实验。结果如图4G，FGA@Fu可以有效跨越上层内皮细胞并被下层4T1细胞摄取。

DCFH-DA可以与细胞内ROS反应并产生具有绿色荧光的DCF，通过CLSM检测纳米粒产生ROS的能力（图5A、S28）。与Fe(III)-CDs和GOx相比，FG产生了明显的绿色荧光，表明其具有更强的ROS产生能力。FGA@Fu组的绿色荧光强度明显降低，而NIR照射后荧光明显增强，这可能是由于系统解聚，暴露活性位点并促进ROS产生。采用总NO检测试剂盒检测NO含量（图5C）。FG组产生的NO较少，而FGA@Fu组在NIR照射后产生的NO较多（11.26 μm），这可能与FGA@Fu中L-Arg的释放和细胞内一氧化氮合酶催化L-Arg产生丰富的NO有关。为了进一步验证细胞内GSH水平的变化，我们使用NDA作为巯基跟踪试剂来标记细胞内GSH（图5D、S29）。与对照组相比，FGA@Fu组的绿色荧光强度没有明显变化，但在NIR照射后荧光强度大幅下降，说明FGA@Fu+NIR具有较强的GSH耗竭能力。为了观察纳米粒对4T1细胞的杀伤作用，我们采用Calcein-AM/PI共染色法（图5E）进行考察。结果显示，FGA@Fu+NIR具有最强的细胞杀伤能力。

为了研究纳米体系在体内对肿瘤的靶向能力和荧光示踪效果，我们通过小动物成像系统检测4T1荷瘤小鼠体内纳米粒的分布（图6A）。FGA@Fu组在12 h时肿瘤部位的荧光强度较高。FGA@Fu+NIR组在12 h后进行NIR照射，与FGA@Fu组相比，24 h时肿瘤部位的荧光强度显著增加，且纳米粒在肿瘤部位的滞留能力显著增强，这可能与NIR照射后体系解聚并产生ROS有关。ROS可活化静息血管内皮细胞，促进P-选择素的表达，从而为后续纳米体系提供更多的靶点，最终实现“自增强”靶向。为了研究纳米粒对肿瘤血管部位的靶向性和渗透性，我们使用CD31标记血管（图6E）。结果显示FGA@Fu+NIR组的红色荧光最强，且主要分布在血管外的肿瘤组织中，这可能是由于NIR照射后热运动性增加，FGA@Fu解聚成更小的纳米粒从而增强了渗透性。此外，解聚的纳米体系可以产生更多的ROS，这也会活化血管内皮细胞，加速纳米粒的渗透。进一步研究了FGA@Fu的“自增强”靶向效果，采用重复注射来模拟后续制剂。通过比较第一次和第二次注射后纳米粒在肿瘤部位的积累来考察自增强靶向能力（图6G）。结果显示FGA@Fu+NIR组第二次注射后的荧光强度明显高于第一次注射。其肿瘤切片结果也显示出更强的P-选择素表达以及更多的纳米粒蓄积（图6H）。

鉴于FGA@Fu良好的体外协同效果和肿瘤靶向能力，我们构建了4T1荷瘤小鼠模型用于研究体内抗肿瘤效果。首先，我们对体内升温效果进行了考察，与生理盐水组相比，FGA@Fu组在NIR照射1 min后肿瘤部位温度升高到42.4°C，这已经超过了肿瘤的耐受温度（≈42°C）。在治疗期间，我们没有观察到小鼠明显的体重减轻（图S35），这表明治疗组的毒性可以忽略不计。此外，如图7A、B、S36所示，生理盐水组肿瘤体积在15天内显著增加，而治疗组增加缓慢甚至减小。其中，FGA@Fu+NIR组的抗肿瘤作用最为显著（肿瘤抑制率为86.0%），这可能与体系高效的靶向作用和光热治疗的多重效果有关。FGA@Fu+NIR组在H&E和TUNEL染色后显示出最为明显的肿瘤细胞凋亡和坏死（图7C）。据报道，肿瘤细胞的早期肺转移常涉及到新血管的形成，而新血管表面往往表达了大量的P-选择素。因此，我们推测FGA@Fu可能会靶向新生血管从而抑制肺转移。我们在治疗结束时收集各组的肺组织，并进行H&E染色分析（图7D、S41），发现FGA@Fu+NIR组的转移灶最少。增强的免疫反应也能抑制肿瘤的转移。基于此，进一步研究纳米粒对肿瘤微环境中免疫应答的影响，包括肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的极化状态和T细胞的比例。我们发现FGA@Fu+NIR组的肿瘤组织中具有更多的抑瘤M1型TAMs和更高的T细胞比例（图7E、F）。密集而复杂的肿瘤细胞外基质（ECM）网络也会严重影响药物在肿瘤内的有效渗透。因此，我们推测，FGA@Fu在NIR照射下优越的抗肿瘤作用可能与光热治疗和NO诱导的肿瘤内胶原溶解有关。通过Masson和免疫荧光染色对肿瘤部位的胶原蛋白进行标记，最后发现FGA@Fu+NIR组的肿瘤组织中具有最少的胶原纤维。

综上所述，为了解决纳米粒靶向性不足和肿瘤部位渗透有限的问题，我们构建了一种自增强靶向肿瘤血管和响应型解聚的纳米平台FGA@Fu。Fu的包覆使该系统能够靶向活化血管内皮细胞。L-Arg的加入使该系统能够在弱酸/NIR条件下实现解聚，并促进ECM中胶原蛋白的消融。FG光热增强的级联催化活性可以增强肿瘤部位的氧化应激、诱导细胞凋亡并活化肿瘤血管内皮细胞。细胞和动物实验表明，FGA@Fu可以实现对肿瘤血管系统的自增强靶向。令人鼓舞的是，FGA@Fu可以达到86.0%的肿瘤抑制率并且具有良好的体内跟踪效果。同时，该纳米平台可有效抑制肺转移，增强免疫反应并抑制EMT。我们希望本研究能够为“自增强靶向设计”的可行性提供更多的支持。

该工作由以下基金支持：

辽宁省教育厅2024年重点基础研究项目